الفحص الكشف عن الاكسدة في خط خلية نجمية الماكر ، G355 - 5
Summary
وهناك طريقة الفحص للكشف عن البيئات الخلوية الاكسدة هو قياس أكسدة CM – H2DCFDA. تتأكسد مرة واحدة داخل الخلية التغييرات CM – H2DCFDA ، من غير الفلورية في مجمع الفلورسنت. ويقاس هذا التغيير في مضان بواسطة التدفق الخلوي ، ويشير إلى عدد من الخلايا في بيئة الأكسدة.
Abstract
آلية غالبا ما اقترح من الفيروس الخلايا العصبية التي يسببها الضرر هو الاكسدة. النجمية لها دور هام في السيطرة على الاكسدة من الجهاز العصبي المركزي (CNS). النجمية مساعدة في الحفاظ على البيئة استتبابي عن الخلايا العصبية ، فضلا عن حماية الخلايا العصبية من أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس). CM – H2DCFDA هو مؤشر الخلية منفذة لوجود ريوس. CM – H 2 DCFDA يدخل الخلية كمركب غير الفلورسنت ، ويصبح بعد الفلورسنت esterases الخلوية إزالة مجموعات أسيتات ، ويتأكسد المجمع. عدد من الخلايا ، التي تقاس التدفق الخلوي ، التي تم العثور عليها لتكون الاستشعاع الأخضر دلالة على عدد من الخلايا التي هي في حالة الأكسدة. CM – H 2 DCFDA عرضة للأكسدة من قبل عدد كبير من ROS مختلفة. هذا النقص في الدقة ، فيما يتعلق التي يمكن أكسدة ريوس CM – H 2 DCFDA ، ويجعل هذا مركب الوصي قيمة لاستخدامها في المراحل الأولى من التحقيق المرضية ، كما يمكن استخدام هذا الاختبار للكشف عن وجود بيئة الأكسدة الخلوية بغض النظر عن الأكسجين الراديكالية أو مزيج من ROS هي المسؤولة عن الاوضاع الخلوية. حالما ثبت أن ريوس موجودة من قبل أكسدة DCFDA 2 CM – H ، ثم يمكن إجراء مزيد من التجارب لتحديد ما الذي تشارك ريوس أو مزيج من روس في عملية المرضية خاص. نتائج هذه الدراسة تثبت مع إضافة بيروكسيد الهيدروجين زيادة في DCFDA 2 CM – H يتألق تم الكشف عن النسبية للضوابط المالحة ، مشيرا إلى أن هذا الاختبار هو اختبار للكشف عن قيمة بيئة الأكسدة داخل الخلايا G355 – 5 ، وهي القطط خط خلية نجمية.
Protocol
Discussion
بفعل آلية المقترحة في كثير من الأحيان من الفيروس الأضرار العصبية الاكسدة هي 1 ، 4 ، 7 ، 9 ، 13 ، 15 ، 16 ، 18-22 ، 27 ، 31. في الأساس ، يقترح أنه من خلال التعرض لفيروسات الدبقية (الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة) الراديكاليين إطلاق الأكسجين التفاعلية ، مثل هيدروكسيد …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر منتجات ReadiSorb لدعمهم السخي لهذه الدراسات.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice. Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).
- Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).
- Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. Glia: the not so innocent bystanders. J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).
- Cooper, A. J., Kristal, B. S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. Biol Chem. 378, 793-802 (1997).
- Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress. J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).
- Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).
- Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity. J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).
- Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M. Neuropathogenesis of AIDS. Mol Med Today. 2, 16-23 (1996).
- Dringen, R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).
- Dringen, R., Hamprecht, B. Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells. Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).
- Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione. J Neurosci. 19, 562-569 (1999).
- Everall, I. P. H. u. d. s. o. n., L, R. W. K. e. r. w. i. n. Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome. Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).
- Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).
- Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. An experimental model system for HIV-1-induced brain injury. Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).
- Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus. Neuroscience. 53, 1-6 (1993).
- Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals. Brain Res. , 677-6345 (1995).
- Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain. J Exp Med. 182, 941-951 (1995).
- Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures. Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).
- Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro. J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).
- Lipton, S. A. Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species. Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).
- Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide. Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).
- Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).
- Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes. Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).
- Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. 2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation. FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).
- Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. Glutathione efflux from cultured astrocytes. J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).
- Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules. Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).
- Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 270, 296-299 (1995).
- Wang, X. F., Cynader, M. S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione. J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).
- Wilson, J. X. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).
- Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia. Glia. 13, 92-100 (1995).
