Nöritik plaklar Alzheimer Hastalığı Fare Modeli Algılama
Summary
AD patolojik özelliklerinden biri Amiloid β proteini pozitif nöritik plakların oluşumu. Immünohistokimyasal algılama thioflavin G boyama yöntemi kullanılarak ABC ve DAB yöntem ve floresan tespiti: Bu protokolde, transgenik AD modeli fareler nöritik plaklar tespit etmek için iki yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Alzheimer hastalığı (AH), demansa neden olan en yaygın nörodejeneratif bir hastalıktır. Nöritik plak oluşumu, Alzheimer hastalığının patolojik işaretlerinden biridir. Nöritik plaklar merkezi bileşeni β-secretase ve γ-secretase beta-amiloid prekürsör protein (APP) sıralı proteolitik bölünme türetilmiş bir küçük ipliksi protein olarak adlandırılan amiloid β proteini (Aβ) 1,. Amiloid hipotezi AD patoloji 2, altta yatan toksik mekanizma olarak plaklar Aγ içeren gerektirir . Nöritik plak varlığı postmortem analiz AD tanısını doğrular. AD patogenezinde Aγ nörobiyoloji anlayışımızı ilerletmek için, AD-ilgili, insan APP genlerindeki mutasyonlar ifade çeşitli fare suşlarının üretildi. Hastalığın şiddetine bağlı olarak, bu farelerde farklı yaşlarda nöritik plaklar gelişecektir. Bu fareler APP işleme yolu ve nöritik plak oluşumunu etkileyebilecek patogenezi ve ilaç geliştirme eğitimi için paha biçilmez bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu protokol, AD modeli farelerde nöritik plaklar belirli tespiti için bir immünohistokimyasal yöntem kullanırlar. ABC ve DAB yöntem ve floresan algılama kullanarak thiofalvin G boyama yöntemi kullanılarak immünohistokimyasal algılama: Biz özellikle yarım beyin, paraformaldehid fiksasyon, cryosectioning, ve AD transgenik farelerin nevrotik plaklar tespit etmek için iki yöntem açılan hazırlık tartışacağız.
Protocol
Discussion
Biotinlenmiş etiketli 4G8 antikor lekeleri AD nöritik plaklar kullanan İmmünohistokimya özgüllük ile modellenen fareler. Boyanması sonucu kantifikasyon ve farklı tedavi grupları arasında plak yükü karşılaştırılması sağlar. Sonucunu etkileyebilecek bazı önemli adımlar vardır. Hemi beyinleri kafatası çıkarma öncesinde perfüze olmadığından, bakım hemi beyin hasarları önlemek amacıyla çıkarma işlemi sırasında kullanılan olmalıdır. Dahası, hemi beyin pasif perfüze olduğundan, biz 4 en az 48 saat% 4 PFA kuluçka tavsiye ° C% 30 sakaroz çözeltisini dalarken önce. Alternatif olarak, transcardial perfüzyon beyin ayıklanması önce yapılması olabilir. Beyin düzgün sabit ise, bir lastik dokusu olmalıdır. Durumda beynin düzgün sabit değildir, bölümler kolayca D'Olomos çözümü veya boyama işlemleri sırasında yırtılabilir.
4G8 monoklonal antikor reaktif amino asit artıkları Aβ, 17-24 ve çekirdek dizisi (VFFAE) epitop tanıdı. 4G8 fare türlerinin türetilmiş olduğundan, daha yüksek bir arka plan boyama vermek eğilimindedir. Bu nedenle, biz, arka plan boyama en aza indirerek hususlar ulaşmak için gerçek bir sinyal ile belirtilen seyreltme bölümleri inkübe seçti.
4G8 antikor kullanarak nöritik plaklar tespiti için immün yanı sıra, bir thioflavin S boyama yöntemi de plaklar tanımlamak için kullanılır. Thioflavin S homojen bir boya karışımı dehydrothiotoluidine metilasyonu sülfonik asit ile elde edilen sonuçlar. Thioflavin G-seçici olmayan beta amiloid oligomerler gibi protein sayfalık içeriği, bağlar. Bağlayıcı üzerine, thioflavin emisyon spektrum karakteristik bir mavi vardiya uğrar. Thioflavin G monomerik formları bağlanma Tersine mavi bir değişimi ortaya çıkarmak ve floresan mikroskop ile tespit edilememiştir. Floresan yoğunluğu amiloid mevduat küçük miktarlarda iyi bir görüntüleme sağlar Thioflavin G boyama amiloid için ekran hızlı bir alternatif sunuyor. Ancak, bir dezavantajı thioflavin G boyama hakkında özgüllük eksikliğidir. Fibrinoids, hiyalin, keratin, vb gibi içeren kapsamlı beta yaprak, dahil olmak üzere birçok diğer doku parçaları, bu boya için oldukça yakınlık var.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR) Townsend, Aile, ve Jack Brown ve Aile Alzheimer Araştırma Vakfı (WAS) tarafından desteklenmiştir. WS Kanada Araştırma Başkanı Alzheimer Hastalığı sahibi. PTTL Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Danışma ve Sağlık Araştırma Bursu için Michael Smith Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
| Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
| Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
| Entellan | EM science | 65037-71 |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Cryostat | Leica | CM-3050-S |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer’s disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer’s disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
