الكشف عن لوحات لالتهاب الأعصاب في مرض ألزهايمر النموذجي ماوس
Summary
واحدة من الخصائص المرضية من ميلادي هو تشكيل لويحات بروتين اميلويد β التهاب الأعصاب إيجابية. في هذا البروتوكول وصفنا طريقتين للكشف عن التهاب الأعصاب لويحات في الفئران المعدلة وراثيا طراز م : كشف المناعى باستخدام الأسلوب ABC و DAB والكشف الفلوري باستخدام طريقة thioflavin S تلطيخ.
Abstract
مرض الزهايمر (ميلادي) هو اضطراب الاعصاب الأكثر شيوعا التي تؤدي إلى الخرف. التهاب الأعصاب تشكيل اللوحة هي واحدة من السمات المميزة المرضية لمرض الزهايمر. العنصر المركزي لويحات لالتهاب الأعصاب هو صغير الخيطية بروتين اميلويد β يسمى البروتين (Aβ) 1 ، وهي مشتقة من الانقسام بروتين متسلسلة من البروتين بيتا اميلويد السلائف (كونا) عن طريق secretase – β γ وsecretase. فرضية الأميلويد يستتبع ذلك Aγ المحتوية على لويحات باعتباره الآلية الأساسية في علم الأمراض السامة م 2. تحليل تشريح الجثة وجود لوحة لالتهاب الأعصاب يؤكد تشخيص ميلادي. لمزيد من فهمنا للبيولوجيا الأعصاب في Aγ المرضية م ، وقد تم توليد سلالات الماوس المختلفة ذات الصلة معربا عن ميلادي طفرات في الجينات البشرية APP. اعتمادا على شدة المرض ، وسيتم تطوير هذه الفئران لويحات لالتهاب الأعصاب في أعمار مختلفة. هذه الفئران بمثابة أدوات لا تقدر بثمن لدراسة تطوير والمخدرات المرضية التي قد تؤثر على مسار معالجة التهاب الأعصاب APP وتشكيل اللوحة. في هذا البروتوكول ، ونحن توظيف أسلوب المناعى للكشف محددة لويحات لالتهاب الأعصاب في نموذج الفئران ميلادي. وسوف نناقش على وجه التحديد من إعداد استخراج المخ نصف التثبيت بارافورمالدهيد ، cryosectioning ، وطريقتين للكشف عن اللوحات العصبية في الفئران المعدلة وراثيا م : كشف المناعى باستخدام الأسلوب ABC و DAB والكشف الفلوري باستخدام طريقة thiofalvin S تلطيخ.
Protocol
Discussion
على غرار المناعية باستخدام biotinylated المسمى البقع الضد 4G8 ويحات التهاب الأعصاب في الفئران ميلادي مع التحديد. نتائج تلطيخ يسمح الكمي والمقارنة بين المجموعات تحميل وحة معاملة مختلفة. هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤثر في النتيجة. لأنه لم يتم perfused أدمغة نصفي قبل الاستخراج من الجمجمة ، ينبغي توخي الحذر أثناء عملية الاستخراج من أجل منع الأضرار التي لحقت نصفي الدماغ. وعلاوة على ذلك ، لأن perfused بسلبية نصفي الدماغ ، نوصي تفرخ في PFA 4 ٪ على الأقل 48 ساعة في 4 درجات مئوية قبل الغطس في حل السكروز 30 ٪. بدلا من ذلك ، يمكن القيام به نضح transcardial قبل استخراج المخ. إذا تم إصلاح الدماغ بشكل صحيح ، يجب أن يكون لديها مطاطي الملمس. في حال لم يتم إصلاح الدماغ بشكل صحيح ، فإن أبواب المسيل للدموع بسهولة في حل Olomos D' أو أثناء إجراءات تلطيخ.
الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 4G8 هو رد الفعل على بقايا من الأحماض الأمينية 17-24 Aβ وأقر حاتمة في التسلسل الأساسية (VFFAE). منذ مشتق من الأنواع 4G8 الماوس ، أنه يميل إلى إعطاء أعلى تلوين الخلفية. وبالتالي ، اخترنا لاحتضان المقاطع في تخفيف وأشارت إلى تحقيق مع الاعتبارات إشارة حقيقية مع تقليل تلوين الخلفية.
بالإضافة إلى immunostaining للكشف عن اللوحات باستخدام الأجسام المضادة لالتهاب الأعصاب 4G8 ، كما يستخدم أسلوب thioflavin S تلطيخ لتحديد ويحات. Thioflavin S هو خليط متجانس الصبغة التي تنتج من مثيلة من dehydrothiotoluidine مع حمض السلفونيك. Thioflavin S غير انتقائي يربط محتويات ورقة بيتا من البروتينات ، مثل تلك الموجودة في oligomers اميلويد. عند ملزمة ، thioflavin يخضع لتحول مميزة الزرقاء من الطيف انبعاثاته. على العكس سيكون ملزما thioflavin S لأشكال موحودي لا تثير تحولا الأزرق وأنه لا يمكن الكشف عنها مع المجهر الفلورسنت. تلطيخ Thioflavin S يوفر بديلا سريعا للكشف عن اميلويد وكثافة مضان تسمح برؤية جيدة للكميات صغيرة من الودائع اميلويد. ومع ذلك ، عيب واحد عن تلطيخ thioflavin S هو عدم وجود خصوصية. العديد من المكونات الأخرى بما فيها الأنسجة التي تحتوي على صفائح بيتا واسعة النطاق ، مثل fibrinoids ، زجاجي ، الكيراتين ، الخ ، وتقارب بدلا عن هذه الصبغة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) ، والأسرة تاونسند ، وجاك براون والأسرة مؤسسة أبحاث الزهايمر (لWAS). كان هو صاحب كرسي أبحاث كندا في مرض الزهايمر. معتمد من قبل PTTL العلوم الطبيعية والهندسة والبحوث المستشار مايكل سميث مؤسسة المنح الدراسية بحوث الصحية.
Materials
| Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
| Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
| Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
| Entellan | EM science | 65037-71 |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Cryostat | Leica | CM-3050-S |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer’s disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer’s disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
