Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo
Summary
Uma das características patológicas da doença de Alzheimer é a formação de amilóide β proteína placas neuríticas positivo. Neste protocolo, descrevemos dois métodos para detectar placas neuríticas em camundongos transgênicos modelo AD: detecção imunohistoquímica utilizando o método ABC e DAB e detecção fluorescente usando o método thioflavin S coloração.
Abstract
Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa levando à demência. Formação de placas neuríticas é uma das características patológicas da doença de Alzheimer. O componente central de placas neuríticas é uma pequena proteína filamentosa proteína chamada amilóide β (Aâ) 1, que é derivada da clivagem proteolítica seqüencial da proteína precursora beta-amilóide (APP) por β-secretase e γ-secretase. A hipótese amilóide implica que Aγ contendo placas como o mecanismo subjacente tóxicos em patologia 2. A análise post-mortem da presença de placas neuríticas confirma o diagnóstico da DA. Para promover nossa compreensão da neurobiologia Aγ na patogênese da AD, várias linhagens de camundongos expressando AD relacionados com mutações nos genes APP humanos foram gerados. Dependendo da gravidade da doença, esses ratos desenvolvem placas neuríticas em diferentes idades. Esses camundongos servem como ferramentas de valor inestimável para o estudo da patogênese e desenvolvimento de drogas que podem afetar o caminho de processamento APP e formação de placas neuríticas. Neste protocolo, empregamos um método imuno-histoquímico para detecção específica de placas neuríticas em camundongos modelo AD. Vamos especificamente discutir a preparação de extrair o cérebro meia, fixação paraformaldeído, cryosectioning, e dois métodos para detectar placas neurótico em camundongos transgênicos AD: detecção imuno-histoquímica usando o método ABC e DAB e detecção fluorescente usando o método thiofalvin S coloração.
Protocol
Discussion
Imunohistoquímica utilizando o anticorpo biotinilado rotulados manchas 4G8 placas neuríticas na AD modelado camundongos com especificidade. O resultado coloração permite a quantificação e comparação da carga de placa bacteriana entre os diferentes grupos de tratamento. Existem vários passos cruciais que poderiam afetar o resultado. Porque o cérebro hemi não são perfundidos antes da extração do crânio, o cuidado deve ser usado durante o processo de extração, a fim de evitar danos para o cérebro hemi. Além disso, uma vez que o cérebro é hemi passivamente perfundidos, recomendamos incubando-o em PFA 4% para pelo menos 48 horas a 4 ° C antes da imersão em solução de sacarose a 30%. Alternativamente, a perfusão transcardial poderia ser feito antes de extrair o cérebro. Se o cérebro é fixada corretamente, ele deve ter uma textura emborrachada. No caso em que o cérebro não é fixa adequadamente, as seções serão rasgões na solução Olomos D'ou durante os procedimentos de coloração.
O anticorpo monoclonal é 4G8 reativa para resíduos de aminoácidos 17-24 de Aâ e reconheceu o epítopo na seqüência do núcleo (VFFAE). Desde 4G8 é derivado de espécies mouse, ele tende a dar uma coloração mais fundo. Assim, optou-se incubar as seções na diluição indicada com considerações para alcançar um verdadeiro sinal, minimizando coloração de fundo.
Além de imunocoloração para a detecção de placas neuríticas usando o anticorpo 4G8, um método thioflavin S coloração também é usado para identificar placas. Thioflavin S é uma mistura homogênea de corante que resulta de metilação de dehydrothiotoluidine com ácido sulfônico. Thioflavin S não se liga seletivamente conteúdo folha beta de proteínas, tais como aquelas em oligômeros amilóide. Após a ligação, thioflavin sofre uma mudança de característica azul do seu espectro de emissão. Por outro lado vinculativo thioflavin S com as formas monoméricas não vai provocar uma mudança de azul e não podia ser detectado com microscópio de fluorescência. Coloração Thioflavin S oferece uma alternativa rápida para triagem de amilóide como a intensidade de fluorescência permite boa visualização de pequenas quantidades de depósitos de amilóide. No entanto, uma desvantagem sobre coloração thioflavin S é a falta de especificidade. Muitos componentes do tecido, incluindo contendo folhas beta extensa, como fibrinoids, hialina, queratina, etc, têm uma afinidade bastante para este corante.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), a Família Townsend, e Jack Brown e Família Alzheimer Research Foundation (para WAS). WS é o titular da Cátedra de Pesquisa do Canadá na Doença de Alzheimer. PTTL é suportado pelas Ciências Naturais e Conselheiro Pesquisa de Engenharia e Michael Smith Fundação de Saúde de Bolsas de Investigação.
Materials
| Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
| Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
| Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
| Entellan | EM science | 65037-71 |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Cryostat | Leica | CM-3050-S |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
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