Обнаружение Neuritic бляшки при болезни Модель мыши Альцгеймера

1. Фиксация мыши мозги и cryosectioning Трансгенные мыши были принесены в жертву использовании углекислого газа, а затем путем обезглавливания и мозга извлечены. Мозг расчлененный продольно в центре. Половина мозга будут заморозки на сухом льду для биохимического анализа. Другие будут затоплены в 4% параформальдегида (PFA), по крайней мере 48 часов при температуре 4 ° C. После фиксации в 4% PFA, по крайней мере 48 часов, мозг геми передается непосредственно на 30% раствором сахарозы и помещен при 4 ° C. В точке, мозг геми должны быть плавающие в растворе сахарозы. Когда мозг геми опустился на дно, как правило, требуется около 48 часов, он готов вложить в октябре для cryosectioning. Перед cryosectioning, смонтировать тонким слоем октября на ручку и позволить заморозить при -20 ° C. Удаление мозжечка от остальной части мозга геми и место на слой замороженного октября Сразу же покрытие мозга геми с октября и дать медленно замерзать при -20 ° C. Как только вложение октября мозг превратился непрозрачным, он будет готов к секционным. Установите толщину каждой секции до 30 мкм. Сбор каждый ломтик в контейнер с раствором D'Olomos. 2. Immunohistochemistry процедура neuritic бляшек (свободное плавание разделы) Обработайте каждую часть в 88% муравьиной кислоты в течение 15 минут. После лечения муравьиная кислота, раздел будет временно свою очередь, непрозрачными и может показаться, сморщиваются. Удалить каждый раздел в тарелку и вымыть с Тх-би-эс (0,3% Тритон Х-100 в PBS) в течение 5 мин х 3 с нежным встряхивания. Блок Эндогенные перекиси блокирование 0,5% H 2 O 2 в Tx-би-эс, RT 30 мин при осторожном встряхивании. Вымойте секция с Tx-PBS в течение 10 мин х 3 с нежным встряхивания. Блок секции с 5% обезжиренного обезжиренного молока, растворенного в Tx-PBS при комнатной температуре в течение 1 часа при осторожном встряхивании. Инкубируйте разделы в первичных антител (биотинилированных 4g8, 1:500-1:2000, перстень) разводят в Tx-би-эс, содержащий 5% молока при температуре 4 ° С в течение ночи с нежным встряхивания. Вымойте секция с Tx-PBS в течение 10 мин х 3 с нежным встряхивания. Подготовка протокола ABC решение следующих производителей (Elite ABC, Vector Laboratories). Инкубируйте разделы ABC смеси в течение 30 мин при осторожном встряхивании. Вымойте секция с Tx-PBS в течение 10 мин х 3 с нежным встряхивания. Подготовка 3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB) (Vector Laboratories) протокол следующие производителя. Инкубируйте разделы DAB смесь в течение 5-10 мин. На данный момент, вы будете наблюдать коричневатого цвета развиваются на каждой секции. Вымойте секция с Tx-PBS в течение 10 мин х 3 с нежным встряхивания. Свободно плавающие разделы мозга установлены на желатин покрытием слайды, чтобы помочь с тканью адгезии. Разделы высушить на открытом воздухе следует поляну с серией ксилол и установлены в Entellen. Бляшки визуализируются при световой микроскопии в 40-кратном увеличении и количественно путем оценки необязательным доска на срез для каждой мыши. 3. Тиофлавина S окрашивание процедурой для обнаружения neuritic бляшек Мышь жертву и порядок мозга экстракции, как указано в разделах 1.1 до 1.5. Горе от 4 до 5 геми мозга разделы на предметное стекло и позволяют полностью высохнуть до окрашивания. Вымойте слайды с 70% этанола в течение 1 минуты. Вымойте слайды с 80% этанола в течение 1 минуты. Инкубируйте слайды в раствор фильтруют (фильтр 0,2 мкм) тиофлавина S (1% в 80% этанола) в течение 15 минут. (Раствор тиофлавина S должна быть отфильтрованы перед каждым использованием). Примечание: защитить тиофлавина S от света и защиты окрашенных слайды из света. Вымойте слайды с 80% этанола в течение 1 минуты. Вымойте слайды с 70% этанола на 1 минуту. Промыть дистиллированной водой в два раза. Горы слайды в водных монтажа средств массовой информации и позволяют слайды сушить в темноте в течение как минимум 2 часа, после чего уплотнения покровное прозрачным лаком ногтей. Витражи разделов следует хранить в темноте при 4 ° C. Зеленая флуоресценция окрашенных бляшки могут быть визуализированы с люминесцентными microscropy. Анализ слайдов в пределах одной недели, потому что окрашивание исчезнет со временем. 4. Представитель Результаты В нашем недавнем исследовании по эффективности противоэпилептических лекарств и стабилизатор настроения вальпроевая кислота (VPA) для подавления neuritic образование зубного налета, мы использовали описанные выше иммунной и тиофлавина S окрашивания процедур по выявлению neuritic бляшек в AD модели мышей (3). Рисунок 1 представляет собой типичную 9 месяца APP23 трансгенные мыши, витражи с анти-Ар использованием биотинилированного 4g8 и обнаружил с помощью метода АВС. Neuritic бляшки четко маркированы антител и обозначены белыми стрелками. Использование окрашивания тиофлавина S, мы обнаружили neuritic осаждения доска 2 месяца APP23xPS траnsgenic мышей (рис. 2). Тиофлавина S связаны Ар-содержащие бляшки neuritic появляется зеленый под флуоресцентной микроскопии (обозначены белыми стрелками). Мы показали, что при лечении VPA, neuritic бляшек значительно снижается (3). В другом исследовании, мы изучили молекулярную связь лежащий в основе гипоксию и AD патогенез. Опять же, используя как 4g8 анти-Ар окрашивания иммуногистохимии и окрашивания тиофлавина S, мы обнаружили, что гипоксия, способствовал формированию Ар содержащие neuritic бляшки (4). Рисунок 1. Иммуногистохимический анализ neuritic бляшек в нашей эры трансгенных мышей. APP23 мышей в возрасте 9 месяцев, были принесены в жертву и были вскрыты, фиксированных и секционные. Neuritic бляшек в гиппокампа были обнаружены с помощью анти-Ар антител 4g8 и были разработаны с использованием ABC и DAB методами. Бляшки были визуализированы с помощью световой микроскопии с 40Х. Белые стрелки указывают на Ар бляшек neuritic. Рисунок 2. Окрашивание тиофлавина к югу от neuritic бляшек в AD моделируется мышей. APP23xPS45 двойной трансгенных мышей на 8 недель и были принесены в жертву были вскрыты, фиксированных и секционные. Neuritic чумы в гиппокампе которые были подтверждены с помощью флуоресцентного окрашивания тиофлавина S и визуализируется с помощью микроскопа при 40-кратном увеличении. Белые стрелки указывают тиофлавина S окрашенных бляшек neuritic.