アルツハイマー病のマウスモデルにおける神経突起斑の検出

1。マウスの脳の固定およびcryosectioning トランスジェニックマウスを断頭し、抽出された脳が続く、二酸化炭素のガスを使用して犠牲にされています。 脳は、中央に縦方向に切開される。脳の半分は、生化学分析のためのドライアイスで凍結フラッシュになります。他は4℃、少なくとも48時間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）℃で水没されます。 少なくとも48時間、4％PFAで固定後、半球の脳を30％ショ糖溶液に直接転送され、4に配置℃に時点では、半球の脳は、ショ糖溶液に浮かんでされるべきである。半球の脳は通常約48時間を必要とする、底に沈んだときに、それはcryosectioning用OCTで埋め込むことができるようになります。 cryosectioningする前に、ノブにOCTの薄層をマウントし、-20℃で凍結することができます冷凍OCTの層の上に半球の脳と場所の他の部分から小脳を削除します。直ちにOCTで半球の脳をカバーし、徐々に-20℃で凍結することができます脳が不透明になっているのOCT包埋後は、区分する準備ができました。 30μm以下の各セクションの厚さを設定します。 D' Olomosソリューションとコンテナに各スライスを収集する。 2。神経突起プラークの免疫組織化学手順（フリーフローティングセクション） 15分間88％ギ酸中の各セクションを扱います。ギ酸処理した後、セクションでは、一時的に不透明に変わり、しぼむように見えることがあります。 静かに撹拌しながら5分間、X 3はTx – PBS（0.3％トリトンX – 100 PBS中）を有するプレートと洗浄に各セクションを削除します。 ブロック内因性過酸化物は、0.5％のTx – PBS、室温でのH 2 O 2穏やかに振盪しながら30分をブロック。 静かに振とうしながら10分X 3のTX – PBSでセクションを洗ってください。 穏やかに振盪しながら1時間室温でのTx – PBSに溶解した5％無脂肪脱脂乳を持つブロックのセクション。 のTx – PBSで穏やかに振盪しながら℃で一晩4℃、5％の牛乳を含むで希釈した一次抗体のセクション（4G8をビオチン、1:500-1:2000、シグネット）をインキュベートする。 静かに振とうしながら10分X 3のTX – PBSでセクションを洗ってください。 ABCのソリューションは、次の製造者のプロトコル（エリートABC、ベクターラボラトリーズ社を、）準備する。穏やかに振盪しながら30分間ABC混合物のセクションをインキュベートする。 静かに振とうしながら10分X 3のTX – PBSでセクションを洗ってください。 3,3' – ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）（ベクターラボラトリーズ）以下の製造業者のプロトコールを準備します。 5〜10分間DABの混合物のセクションをインキュベートする。この時点で、茶色がかった色の各セクションでの開発を遵守します。 静かに振とうしながら10分X 3のTX – PBSでセクションを洗ってください。 フリーフローティング脳切片は、組織の癒着を支援するため、ゼラチンコートしたスライド上にマウントされています。セクションは、その後、空気はキシレンのシリーズでクリアすることで、続くとEntellenにマウントされている乾燥させる。 プラークは、40X倍率で光学顕微鏡下で可視化し、各マウスのスライス当たりの平均プラーク数を評価することによって定量化されています。 3。神経突起プラークの検出のためのチオフラビンS染色手順マウスの犠牲と脳の抽出手順は、セクション1.1から1.5に示されている。 スライドガラス上に4から5半の脳切片をマウントし、完全に染色する前に空気乾燥することができます。 1分間70％エタノールでスライドを洗浄します。 1分間80％エタノールでスライドを洗浄します。 15分のためにフィルター（0.2μmのフィルター）チオフラビンS溶液（エタノールの80％で1％）でスライドをインキュベートする。 （チオフラビンS溶液は使用前にフィルタリングする必要がある）。注意：光からチオフラビンSを保護し、光から染色したスライドを保護する。 1分間80％エタノールでスライドを洗浄します。 70％エタノール1分でスライドを洗浄します。 二回蒸留水で洗ってください。 水性マウントメディアのマウントのスライドとスライドの明確なマニキュアでカバーガラスをシールに続いて、少なくとも2時間、暗所で乾燥させます。染色した切片を4℃で暗所に保管してください緑色蛍光染色されたプラークには、蛍光microscropyで可視化することができます。染色が時間とともにフェードアウトするので、一週間以内にスライドを分析する。 4。代表的な結果老人斑の形成を抑制する抗てんかん薬や気分安定剤バルプロ酸（VPA）の有効性に関する我々の最近の研究では、我々は、ADのモデルマウス（3）の神経突起プラークを識別するために、上述の免疫染色し、チオフラビンS染色の手順を使用していました。図1は、抗Aβ使用してビオチン化4G8で染色し、ABCのメソッドを介して検出された、典型的な9ヶ月古いAPP23トランスジェニックマウスを表します。老人斑は明確抗体で標識され、白い矢印で示されている。チオフラビンS染色を使用して、我々は2ヶ月古いAPP23xPS TRA老人斑の沈着を検出nsgenicマウス（図2）。チオフラビンSバウンドAβ含有神経突起斑（白い矢印で示される）、蛍光顕微鏡下で緑色に表示されます。我々は、VPAの治療で、老人斑の形成が有意に（3）減少することを示した。別の研究では、我々は低酸素症およびADの病因の根底にある分子のリンクを学んだ。再び、4G8抗Aβ免疫組織化学染色およびチオフラビンS染色の両方を使用して、我々は低酸素症は老人斑を（4）を含むAβの形成を容易に発見。 図1。 ADトランスジェニックマウスにおける老人斑の形成の免疫組織化学的分析。9ヶ月歳の時にAPP23マウスは屠殺し、解剖した、固定し、切片。海馬での神経突起プラークは、抗Aβ抗体4G8を用いて検出したとABCとDABの方法を使用して開発されました。プラークは、40Xと光学顕微鏡により可視化した。白い矢印は、Aβ神経突起斑を指す。 図2。 ADモデル化されたマウスにおける神経突起斑のチオフラビンS染色。8週齢でAPP23xPS45ダブルトランスジェニックマウスを屠殺し、解剖した、固定し、切片。海馬での神経突起の災害は、チオフラビンS蛍光染色を用いて確認して40Xの倍率で顕微鏡により可視化されたされています。白い矢印は、チオフラビンS染色された神経突起斑を示している。