Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell
Summary
Einer der pathologischen Merkmale von AD ist die Bildung von Amyloid β Protein positive neuritischen Plaques. In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Methoden, um neuritischen Plaques in transgenen AD-Modell-Mäusen zu erkennen: immunhistochemischen Nachweis über die ABC-und DAB-Methode und Fluoreszenzdetektion mit Thioflavin S-Färbung.
Abstract
Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung, die zu Demenz. Neuritischen Plaquebildung ist einer der pathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit. Die zentrale Komponente des neuritischen Plaques ist ein kleiner faserigen Protein namens Amyloid β Protein (Aß) 1, die aus der sequenziellen proteolytische Spaltung des beta-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) durch β-Sekretase und γ-Sekretase abgeleitet ist. Die Amyloid-Hypothese zur Folge, dass Aγ-haltigen Plaques als die zugrunde liegende toxische Mechanismus in AD-Pathologie 2. Die Obduktion Analyse der Präsenz von neuritischen Plaques bestätigt die Diagnose von AD. Um unser Verständnis von Aγ Neurobiologie in AD Pathogenese wurden verschiedene Maus-Stämme, die AD-bezogenen Mutationen im menschlichen APP-Gene erzeugt. Je nach Schwere der Erkrankung, werden diese Mäuse neuritischen Plaques in den verschiedenen Altersstufen zu entwickeln. Diese Mäuse dienen als unschätzbare Werkzeuge für das Studium der Pathogenese und Entwicklung von Medikamenten, die die APP-Prozessierung Weg und neuritischen Plaquebildung beeinflussen könnten. In diesem Protokoll, beschäftigen wir eine immunhistochemische Methode zum spezifischen Nachweis von neuritischen Plaques in AD-Modell-Mäusen. Wir werden insbesondere über die Vorbereitung von der Gewinnung der Hälfte des Gehirns, Paraformaldehyd Fixierung Kryoschneiden und zwei Methoden zur neurotischen Plaques in AD transgenen Mäusen zu erkennen: immunhistochemischen Nachweis über die ABC-und DAB-Methode und Fluoreszenzdetektion mit thiofalvin S-Färbung.
Protocol
Discussion
Immunhistochemie mit dem biotinylierten gekennzeichnet 4G8 Antikörper Flecken neuritischen Plaques in AD modelliert Mäuse mit Spezifität. Die Färbung Ergebnis ermöglicht die Quantifizierung und Vergleich der Plaque-Last zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die das Ergebnis beeinflussen könnten. Da die hemi Gehirne nicht vor der Extraktion aus dem Schädel perfundiert, sollte darauf bei der Extraktion verwendet werden, um Schäden an der hemi Gehirn zu verhindern. Da darüber hinaus die hemi Gehirn passiv durchströmt wird, empfehlen wir Inkubation in 4% PFA für mindestens 48 Stunden bei 4 ° C vor dem in der 30% Saccharose-Lösung eingetaucht. Alternativ könnte transcardial Perfusion vor der Extraktion des Gehirns durchgeführt werden. Wenn das Gehirn richtig befestigt ist, sollte es eine gummiartige Konsistenz. In dem Fall, dass das Gehirn noch nicht behoben ist richtig, werden die Abschnitte leicht in die D'Olomos Lösung oder während der Färbeverfahren reißen.
Die 4G8 monoklonalen Antikörper reaktiv Aminosäurereste 17-24 von Aß und erkannte die Epitop in der Core-Sequenz (VFFAE). Da 4G8 aus Maus Arten abgeleitet wird, neigt sie dazu, eine höhere Hintergrundfärbung zu geben. So entschieden wir uns, um die Abschnitte zu den angegebenen Verdünnung mit Überlegungen zur Erreichung eines echten Signals bei gleichzeitiger Minimierung der Hintergrundfärbung inkubieren.
Zusätzlich zur neuritischen Plaques Detektion mit dem 4G8 Antikörper Immunfärbung ist ein Thioflavin S Färbemethode auch verwendet, um Plaques zu identifizieren. Thioflavin S ist eine homogene Mischung Farbstoff, der sich aus Methylierung von Dehydrothiotoluidin mit Sulfonsäuregruppen. Thioflavin S nicht selektiv bindet Beta-Faltblatt-Inhalte von Proteinen, wie sie in Amyloid-Oligomere. Bei der Bindung erfährt Thioflavin eine charakteristische blaue Verschiebung seines Emissionsspektrums. Umgekehrt Thioflavin S Bindung an die monomeren Formen nicht zu entlocken eine Blauverschiebung und konnte nicht mit Fluoreszenz-Mikroskop detektiert werden. Thioflavin S-Färbung ist eine schnelle Alternative zum Bildschirm für die Amyloid als die Intensität der Fluoreszenz ermöglicht eine gute Darstellung von kleinen Mengen von Amyloid-Ablagerungen. Allerdings ist ein Nachteil zu Thioflavin S-Färbung der mangelnden Spezifität. Viele andere Gewebe Komponenten, einschließlich mit umfangreichen Beta-Faltblätter, wie fibrinoids, hyaline, Keratin, etc, haben eine eher Affinität zu diesem Farbstoff.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die Townsend Familie und Jack Brown und Familie Alzheimer Research Foundation (WAS) unterstützt. WAS ist der Inhaber des Canada Research Chair in der Alzheimer-Krankheit. PTTL wird vom kanadischen Natural Sciences and Engineering Research Counsel und Michael Smith Foundation for Health Research Scholarship unterstützt.
Materials
| Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
| Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
| Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
| Entellan | EM science | 65037-71 |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Cryostat | Leica | CM-3050-S |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
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