Eine neuartige Methode, um Makrophagen aus primären Kultur von Leberzellen zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode nutzt die Proliferation von Makrophagen in der Kultur, durch Schütteln der Kulturflaschen und Reinigung durch selektive Bindung an Plastikschalen gefolgt. Diese Technik bietet effiziente Leber Makrophagen ohne komplexe Anlagen und Fähigkeiten.
Kupffer-Zellen sind Leber-spezifische Makrophagen und spielen eine wichtige Rolle in der physiologischen und pathologischen Funktionen der Leber 1-3. Obwohl die Isolierung Methoden der Leber Makrophagen wurden gut beschrieben 4-6, erfordern die meisten dieser Methoden gehobene Ausstattung, wie eine Zentrifugalkraft elutriator und technischen Fähigkeiten. Hier bieten wir eine neuartige Methode zur Leber Makrophagen in ausreichender Zahl und Reinheit zu erhalten aus gemischten primären Kulturen von adulten Ratten Leberzellen, wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
Nach Dissoziation der Leberzellen durch Zwei-Schritt-Perfusion-Methode 7,8, einem Bruchteil meist parenchymatösen Hepatozyten besteht vorbereitet und entkernt in T75 Zellkulturflaschen mit Kulturmedium DMEM und 10% FCS.Parenchymal Hepatozyten besteht verlieren die Epithelzellen Morphologie innerhalb von wenigen Tagen in Kultur, degenerieren oder Umwandlung in Fibroblasten-ähnlichen Zellen (Abbildung 2). Wie die Kultur geht, um den Tag 6, Phasenkontrast-hellen, starten rund Makrophagen-ähnlichen Zellen auf die Fibroblasten Zellrasen vermehren (Abbildung 2). Das Wachstum der Makrophagen-ähnlichen Zellen weiter und erreichen Höchstwerte um 12 Tage, für die Zellschicht auf der Flasche Oberfläche. Durch Schütteln der Kulturflaschen, sind Makrophagen leicht in das Kulturmedium suspendiert. Nachfolgende Übertragung und kurze Inkubation in Plastikschalen Ergebnis der selektiven Adhäsion von Makrophagen (Abbildung 3), wo andere kontaminierenden Zellen suspendiert bleiben. Nach mehreren Spülungen mit PBS, angeschlossen sind Makrophagen geerntet. Mehr als 10 6 Zellen können wieder aus dem gleichen T75 Zellkulturflasche auf zwei vor drei tägigen Intervallen geerntet werden für mehr als zwei Wochen (Abbildung 3). Die Reinheiten der isolierten Makrophagen wurden 95 bis 99%, wie mittels Durchflusszytometrie ausgewertet oder Immunzytochemie mit Ratten-Makrophagen-spezifischen Antikörpern (Abbildung 4). Die isolierten Zellen zeigen aktive Phagozytose von polystylene Perlen (Abbildung 5), proliferative Reaktion auf rekombinantes GM-CSF, die Sekretion von entzündlichen / anti-inflammatorischen Zytokinen nach Stimulation mit LPS und Bildung vielkernigen Riesenzellen 9.
Abschließend stellen wir eine einfache und effiziente Methode, um Leber-Makrophagen in ausreichender Zahl und Reinheit zu erhalten, ohne komplexe Anlagen und skills.This Methode auf andere Säugetierarten können.
Hier berichten wir über eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus dem gemischten primären Kulturen von adulten Ratten Leberzellen zu erhalten. Unsere Methode beruht zunächst auf dem Roman proliferative Aktivität von Makrophagen in der Mischkultur von Leberzellen, und anschließender Isolierung und Aufreinigung dieser Zellen auf der Basis ihrer biologischen Eigenschaften wie Makrophagen 9. Es kann möglich sein die Makrophagen in der gemischten Primärkultur von erwachsenen Leberzellen vermehrt könnte von Kupffer oder verwandten Zellen, die in den parenchymatösen Hepatozyten Bruchteil kontaminierten entstanden sein. Die Makrophagen könnte zu spezifischen Veränderungen der Umwelt durch Umwandlung von parenchymatösen Hepatozyten 10 und andere Fibroblasten-Zellen in der gemischten primären Kulturen verursacht geantwortet haben.
Zusammenfassend bietet unsere Methode Isolierung von Makrophagen-ähnlichen Zellen in ausreichender Zahl und Reinheit aus dem primären Kultur von Rattenleber cellswithout mit hoch entwickelten Geräten und technischen Fähigkeiten. Darüber hinaus kann die Isolierung Verfahren mit der gleichen Kulturflasche für mehr als zwei Wochen wiederholt werden. Diese Methode könnte auch für andere Säugetierarten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium und ein Grant-in-Aid aus dem Food Nanotechnologie Projekt des Ministeriums für Landwirtschaft, Forsten und Fischerei Japans. Finanzierte
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) |
Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
Fetal calf serum (FCS) | HyClone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
Cell scraper | Corning Inc. | 3010 | |
Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |