وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار
Summary
تم وصف أسلوب الرواية للحصول على الضامة من الثقافة الأساسية للخلايا كبد الفئران. هذا الأسلوب يستخدم انتشار الضامة في الثقافة ، تليها اهتزاز قوارير الثقافة وتنقية عن طريق الحجز الانتقائي لأطباق بلاستيكية. هذا الأسلوب يوفر كفاءة الضامة الكبد بدون معدات معقدة والمهارات.
Abstract
خلايا كوبفر هي الضامة المقيمين الكبد محددة وتلعب دورا هاما في الوظائف الفسيولوجية والمرضية في الكبد 1-3. على الرغم من أن أساليب عزل الضامة الكبد وقد موصوفة وصفا جيدا 4-6 ، ومعظم هذه الطرق تحتاج إلى معدات متطورة ، مثل elutriator الطرد المركزي والمهارات التقنية. هنا ، ونحن نقدم طريقة جديدة للحصول على الضامة الكبد في عدد كاف من النقاء والثقافات الابتدائية المختلطة الكبار خلايا الكبد الفئران ، تخطيطي كما هو موضح في الشكل 1.
بعد تفكك خلايا الكبد من قبل اثنين من خطوة طريقة الارواء 7،8 ، تعد جزءا تتألف في معظمها من خلايا الكبد متني والمصنفة في قوارير T75 زراعة الأنسجة مع مستنبت تتكون من خلايا الكبد وDMEM FCS.Parenchymal 10 ٪ تفقد مورفولوجيا الخلايا الظهارية في غضون بضعة أيام في الثقافة ، أو تتحول إلى تحويل الخلايا الليفية مثل (الشكل 2). كما العائدات والثقافة ، وحول يوم 6 ، المرحلة التباين الساطع ، على مدار بلعم شبيهة تبدأ الخلايا في التكاثر على الورقة خلية ليفية (الشكل 2). نمو خلايا البلاعم مثل الاستمرار والوصول إلى أقصى مستويات حول 12 ايام ، وتغطي الورقة على سطح الخلية القارورة. التي تهز من القوارير والثقافة ، وتعلق بسهولة الضامة في المتوسط الثقافة. ونقل لاحقا في حضانة قصيرة نتيجة الصحون البلاستيكية في التصاق الانتقائي للالضامة (الشكل 3) ، حيث تظل معلقة وغيرها من الخلايا الملوثة. يشطف بعد عدة مع برنامج تلفزيوني ، ويتم حصاد الضامة المرفقة. يمكن حصاده أكثر من 10 6 خلايا مرارا وتكرارا من نفس الأنسجة T75 قارورة الثقافة اليوم على فترات 2-3 لأكثر من أسبوعين (الشكل 3). درجات نقاء من الضامة معزولة كان 95 الى 99 ٪ ، وتقييمها من قبل التدفق الخلوي أو كيمياء سيتولوجية مناعية مع الاجسام المضادة المحددة بلعم الفئران (الشكل 4). خلايا معزولة تظهر البلعمة نشطة من الخرز polystylene (الشكل 5) ، والاستجابة لالتكاثري المؤتلف GM – CSF ، إفراز التهاب / مضادة للالتهاب السيتوكينات على التحفيز مع LPS ، وتشكيل عملاق الخلايا multinucleated 9.
في الختام ، ونحن نقدم طريقة بسيطة وفعالة للحصول على الضامة الكبد في عدد كاف والنقاء بدون معدات معقدة وskills.This طريقة يمكن تطبيقها على الأنواع الأخرى من الثدييات.
Protocol
Discussion
هنا ، نحن تقرير طريقة بسيطة وفعالة للحصول على الضامة من ثقافات الابتدائية المختلطة الكبار خلايا الكبد الفئران. أسلوبنا يعتمد أولا على النشاط التكاثري رواية الضامة في ثقافة مختلطة من خلايا كبد الفئران ، ومن ثم عزل وتنقية لاحق من هذه الخلايا على أساس خصائصها البيولوجية والضامة 9. قد يكون من الممكن الضامة انتشرت في الثقافة الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار قد نشأت من خلايا كوبفر أو ذات الصلة التي الملوثة في كسر خلايا الكبد متني. قد استجابت الضامة مع التغيرات البيئية الناجمة عن التحول معينة من الخلايا الكبدية متني 10 ليفية وغيرها من الثقافات الابتدائية المختلطة.
في الختام ، اسلوبنا يوفر عزل خلايا البلاعم التي تشبه في عدد كاف من النقاء والثقافة الأساسي من الفئران الكبد cellswithout باستخدام معدات متطورة ومهارات فنية. بالإضافة ، يمكن تكرار إجراء العزل مع قارورة الثقافة نفسها لأكثر من أسبوعين. قد تكون هذه الطريقة تنطبق على الأنواع الأخرى من الثدييات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة البحث ومنحة في والمعونة. الأغذية من مشروع تقنية النانو في وزارة الزراعة والغابات ومصائد الأسماك في اليابان
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) |
Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | HyClone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning Inc. | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell, . Liver fibrosis: the hepatocyte revisited. Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).
