Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.
Las células de Kupffer son el hígado específicos de los macrófagos residentes y juegan un papel importante en las funciones fisiológicas y patológicas del hígado 1-3. Aunque los métodos de aislamiento de los macrófagos del hígado han sido bien descritos por 4-6, la mayor parte de estos métodos requiere de equipo sofisticado, como un elutriador centrífuga y habilidades técnicas. En este sentido, proporcionar un nuevo método para obtener los macrófagos del hígado, en cantidad y pureza de la mezcla de cultivos primarios de células de hígado de rata adulta, como se ilustra esquemáticamente en la Figura 1.
Después de la disociación de las células del hígado en dos etapas método de perfusión 7,8, una fracción compuesta principalmente por los hepatocitos del parénquima se prepara y se sembró en frascos T75 de cultivo de tejidos con medio de cultivo compuesto por DMEM y 10% de los hepatocitos FCS.Parenchymal perder la morfología de las células epiteliales dentro de unos días en la cultura, degenerada o transformarse en células similares a fibroblastos (Figura 2). A medida que avanza la cultura, alrededor del día 6, de contraste de fase brillante, redondo como los macrófagos-células comienzan a proliferar en la lámina de células fibroblastos (Figura 2). El crecimiento de las células como los macrófagos-continuar y llegar a los niveles máximos alrededor del día 12, que cubre la capa celular en la superficie del frasco. Por agitación de los frascos de cultivo, los macrófagos son fácilmente suspendidas en el medio de cultivo. Posterior traslado e incubación corto en el resultado platos de plástico en la adhesión selectiva de los macrófagos (Figura 3), donde, como otras células contaminantes permanecen suspendidas. Después de varios lavados con PBS, los macrófagos adjunta se recogen. Más de 10 6 células pueden ser cosechadas varias veces de la misma T75 frasco de cultivo de tejidos de dos a intervalos de tres días por más de dos semanas (Figura 3). Las purezas de los macrófagos aislados de 95 a 99%, tal como se evaluó por citometría de flujo o inmunocitoquímica con ratas macrófagos anticuerpos específicos (Figura 4). Las células aisladas muestran fagocitosis activa de cuentas polystylene (Figura 5), la respuesta proliferativa a GM-CSF recombinante, la secreción de antiinflamatorios / anti-citoquinas inflamatorias a la estimulación con LPS, y la formación de células gigantes multinucleadas 9.
En conclusión, nos proporcionan un método simple y eficiente para obtener los macrófagos del hígado, en cantidad y pureza, sin un equipo complejo y skills.This método podría ser aplicable a otras especies de mamíferos.
Aquí, se presenta un método simple y eficiente para obtener los macrófagos de la mezcla de culturas primarias de adultos células de hígado de rata. Nuestro método se basa primero en la novedosa actividad proliferativa de macrófagos en el cultivo mixto de células de hígado de rata, y posterior aislamiento y purificación de estas células sobre la base de sus características biológicas como los macrófagos 9. Puede ser posible que los macrófagos proliferan en el cultivo mixto primarios de células de hígado en adultos podría haberse originado a partir de Kupffer o las células relacionadas que contaminó en la fracción del parénquima hepatocitos. Los macrófagos podrían haber respondido a determinados cambios ambientales provocados por la transformación de las células del parénquima hepatocitos fibroblástica 10 y otros en los cultivos primarios mixtos.
En conclusión, el método proporciona un aislamiento de los macrófagos-células en cantidad suficiente y la pureza del cultivo primario de hígado de rata cellswithout utilizando sofisticados equipos y conocimientos técnicos. Además, el procedimiento de aislamiento se puede repetir con el mismo frasco de cultivo por más de dos semanas. Este método podría ser aplicable a otras especies de mamíferos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por una beca de investigación y una beca en la ayuda del Proyecto de Nanotecnología de Alimentos del Ministerio de Agricultura, Silvicultura y Pesca de Japón.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) |
Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
Fetal calf serum (FCS) | HyClone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
Cell scraper | Corning Inc. | 3010 | |
Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |