Une nouvelle méthode pour obtenir des macrophages de culture primaire de cellules de foie de rat est décrit. Cette méthode utilise la prolifération des macrophages dans la culture, suivie par la secousse de flacons de culture et de la purification par l'attachement sélectif plats en plastique. Cette technique fournit efficacement des macrophages du foie, sans équipement complexe et des compétences.
Les cellules de Kupffer sont les macrophages résidents du foie spécifiques et jouent un rôle important dans les fonctions physiologiques et pathologiques du foie 1-3. Bien que les méthodes d'isolement des macrophages du foie ont été bien décrits 4-6, la plupart de ces méthodes nécessitent des équipements sophistiqués, comme une élutriateur centrifuges et des compétences techniques. Ici, nous proposons une nouvelle méthode pour obtenir des macrophages du foie, en nombre suffisant et la pureté du mélange des cultures primaires de cellules de foie de rat adulte, comme illustré schématiquement à la figure 1.
Après dissociation des cellules du foie en deux étapes la méthode de perfusion 7,8, une fraction essentiellement composée des hépatocytes parenchymateux est préparée et ensemencée dans T75 flacons de culture tissulaire avec un milieu de culture composé de DMEM et 10% des hépatocytes FCS.Parenchymal perdent la morphologie des cellules épithéliales dans quelques jours dans la culture, dégénèrent ou se transforment en cellules de type fibroblaste (figure 2). Comme le produit de la culture, autour du jour 6, contraste de phase-lumineux, rond cellules de type macrophage commencent à proliférer sur la feuille de cellules fibroblastiques (figure 2). La croissance des cellules de type macrophage poursuivre et atteindre des niveaux maximum autour de 12 jours, couvrant la couche de cellules sur la surface du flacon. En secouant les flacons de culture, les macrophages sont facilement en suspension dans le milieu de culture. Le transfert ultérieur et d'incubation est courte dans le résultat des plats en plastique dans l'adhésion sélective des macrophages (figure 3), où, comme d'autres cellules contaminantes restent suspendues. Après plusieurs rinçages avec du PBS, les macrophages attachés sont récoltés. Plus de 10 6 cellules peuvent être récoltées à plusieurs reprises à partir du même flacon T75 culture de tissus de deux à trois jours d'intervalle pendant plus de deux semaines (figure 3). Les puretés des macrophages isolés étaient de 95 à 99%, évaluée par cytométrie de flux ou immunocytochimie avec des macrophages chez le rat des anticorps spécifiques (figure 4). Les cellules isolées montrent phagocytose active de perles polystylene (figure 5), réponse proliférative à la GM-CSF recombinant, la sécrétion des maladies inflammatoires / anti-inflammatoires des cytokines après stimulation par le LPS, et la formation de cellules géantes multinucléées 9.
En conclusion, nous proposons une méthode simple et efficace pour obtenir des macrophages du foie, en nombre suffisant et la pureté sans équipement complexe et skills.This méthode pourrait s'appliquer à d'autres espèces de mammifères.
Nous rapportons ici une méthode simple et efficace d'obtenir des macrophages dans les cultures mixtes primaires de l'adulte les cellules du foie de rat. Notre méthode repose d'abord sur l'activité proliférative roman de macrophages dans la culture mixte de cellules de foie de rat, puis l'isolement et la purification ultérieure de ces cellules sur la base de leurs caractéristiques biologiques comme les macrophages 9. Il peut être possible les macrophages proliféré dans la culture mixte de cellules primaires du foie adulte peut provenir de Kupffer ou des cellules liées qui ont contaminé dans la fraction du parenchyme hépatocytes. Les macrophages pourraient avoir répondu à des changements environnementaux causés par la transformation du parenchyme hépatocytaire 10 et d'autres cellules fibroblastiques dans les cultures mixtes primaires.
En conclusion, notre méthode permet d'isoler des cellules de type macrophage, en nombre suffisant et la pureté de la culture primaire de foie de rat en utilisant cellswithout équipements sophistiqués et des compétences techniques. En outre, la procédure d'isolement peut être répétée avec le ballon de la même culture pendant plus de deux semaines. Cette méthode pourrait être applicable à d'autres espèces de mammifères.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par une subvention de recherche et une subvention en aide à partir du projet nanotechnologie alimentaire du Ministère de l'Agriculture, des Forêts et des Pêches du Japon.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) |
Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
Fetal calf serum (FCS) | HyClone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
Cell scraper | Corning Inc. | 3010 | |
Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |