שיטה חדשנית להשיג מקרופאגים מתרבות העיקרי של תאים בכבד חולדה מתואר. שיטה זו מנצלת את ריבוי של מקרופאגים בתרבות, ואחריו רעד של צלוחיות תרבות וטיהור על ידי התקשרות סלקטיבית מנות פלסטיק. טכניקה זו יעילה מספק מקרופאגים הכבד ללא ציוד מיומנויות מורכבות.
תאים בכבד Kupffer הם ספציפיים מקרופאגים תושב לשחק תפקיד חשוב פונקציות פיזיולוגיים ופתולוגיים של הכבד 1-3. למרות שיטות הבידוד של מקרופאגים הכבד כבר היטב תיאר 4-6, רוב השיטות האלה דורשות ציוד מתוחכם, כגון elutriator צנטריפוגלי וכישורים טכניים. כאן, אנו מספקים שיטה חדשה להשיג מקרופאגים הכבד במספר טוהר מספיק מתרבויות העיקרי מעורבת של תאים בכבד חולדה מבוגר, כפי שמודגם סכמטי באיור 1.
לאחר ניתוק של תאים בכבד על ידי שני שלבים 7,8 שיטה זלוף, שבר מורכב ברובו hepatocytes parenchymal ערוכה seeded לתוך T75 תרבות צלוחיות עם רקמה בינוני תרבות מורכבת DMEM hepatocytes FCS.Parenchymal ו 10% לאבד את המורפולוגיה תא אפיתל בתוך ימים ספורים בתרבות, מנוונת או להפוך תאים דמויי פיברובלסטים (איור 2). כמו תרבות התמורה, סביב יום 6, שלב בניגוד בהיר, עגול macrophage כמו התאים מתחילים להתרבות בגיליון תא fibroblastic (איור 2). הצמיחה של macrophage דמויי תאים להמשיך ולהגיע לרמות היותר סביב 12 יום, המכסים את הגיליון התא על פני הבקבוק. על ידי רועדת של צלוחיות תרבות, מקרופאגים מושעים בקלות לתוך המדיום לתרבות. לאחר העברת ו דגירה קצרה בעקבות הידבקות צלחות פלסטיק סלקטיבית של מקרופאגים (איור 3), שם כמו תאים מזהמים אחרים נשארים תלויים. אחרי כמה שטיפות עם PBS, מקרופאגים מצורף נקצרים. יותר מ 10 6 תאים ניתן לקצור שוב ושוב במשך יותר משבועיים (איור 3) מן הבקבוק רקמות זהה T75 התרבות בשעה 02:58 במרווחים יום. Purities של מקרופאגים מבודד היו 95-99%, כפי מוערך על ידי cytometry זרימה או immunocytochemistry עם macrophage נוגדנים ספציפיים חולדה (איור 4). בתאים מבודדים להראות phagocytosis פעיל של חרוזים polystylene (איור 5), בתגובה על שגשוג רקומביננטי GM-CSF, הפרשת דלקתי / אנטי דלקתיות ציטוקינים על גירוי עם LPS, היווצרות של תאים ענק multinucleated 9.
לסיכום, אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה כדי להשיג מקרופאגים הכבד במספר טוהר מספקת וללא ציוד skills.This מורכבות השיטה עשויה להיות ישימה מיני יונקים אחרים.
כאן אנו מדווחים שיטה פשוטה ויעילה כדי להשיג מקרופאגים מן התרבויות העיקרי מעורבת של תאים בכבד חולדה מבוגר. השיטה שלנו מתבססת הראשון על פעילות שגשוג הרומן של מקרופאגים בתרבות מעורבת של תאים בכבד חולדה, ואחר כך בידוד וטיהור עתידיים של תאים אלה על בסיס המאפיינים הביולוגיים שלהם, כמו מקרופאגים 9. אפשר אולי מקרופאגים התרבו בתרבות העיקרי מעורבת של תאים בכבד מבוגר שאולי מקורם Kupffer או תאים הקשורים זה מזוהמים לתוך השבר hepatocytes parenchymal. מקרופאגים אולי הגיב לשינויים סביבתיים ספציפיים שנגרמו על ידי הפיכתו של hepatocyte תאים parenchymal fibroblastic 10 אחרים בתרבויות העיקרי מעורבת.
לסיכום, השיטה שלנו מספק בידוד של macrophage דמויי תאים במספר טוהר מספיק מן התרבות העיקרי של הכבד עכברוש cellswithout באמצעות ציוד מתוחכם מיומנויות טכניות. בנוסף, הליך הבידוד ניתן לחזור עם בקבוק התרבות אותו במשך יותר משבועיים. שיטה זו עשויה להיות ישימה מיני יונקים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר גרנט-in-Aid מפרויקט ננוטכנולוגיה מזון של משרד החקלאות, יערנות, דיג ו של יפן.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) |
Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
Fetal calf serum (FCS) | HyClone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
Cell scraper | Corning Inc. | 3010 | |
Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |