Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

1. Perfusione del Fegato Anestetizzare un adulto maschio di ratto Sprague-Dawley (a 10 a 15 settimane di età, peso corporeo 150-200 g) con un'iniezione intraperitoneale di una soluzione di sodio pentobarbital (50 mg di sodio pentobarbital / kg di peso corporeo). Posto l'animale in una padella in acciaio e spray etanolo al 70% sul suo addome e torace. Fai un piccolo taglio e di staccare la pelle. Aperto l'addome dal taglio con un paio di forbici. Confermare la posizione di vena porta, passa un filo chirurgico sotto la vena porta e liberamente si aggregano. Clump la parte distale della vena cava inferiore e la vena mesenterica per prevenire il reflusso del sangue nel fegato. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma con le forbici, ed esporre il cuore. Inserire un catetere di plastica (2 mm di diametro) nella vena porta e serrare saldamente il filo intorno al catetere. Collegare il catetere ad un sistema di perfusione che viene caricato con soluzione di lavaggio (Ca 2 +-Mg 2 + HBSS gratuito contenente 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM e 4,2 mM NaHCO 3; pH 7,2) preriscaldata a 37 ° C. Iniziare perfusione in situ a una velocità di 10 ml / min. Allo stesso tempo, fare un taglio nella parete dell'atrio destro. Continua perfusione per 10 minuti. Accendere la soluzione di perfusione alla soluzione collagenasi [HBSS contenente HEPES 10mm e 4,2 mm NaHCO 3 integrati con collagenasi di tipo I (0,05%) e inibitori della tripsina (50 mg / ml), pH 7,5], e profumato per 10 – 20 minuti a una velocità di 10 ml / min fino a quando il fegato si gonfia leggermente e mostra il segno di disintegrazione della struttura del fegato sotto membrana sierosa. 2. Preparazione di epatociti parenchimale ricchi frazione di cellule Rimuovere e trasferire con cautela il fegato in un bicchiere sterile contenente 25 ml di soluzione di collagenasi. Tritare in piccoli pezzi con le forbici. Aggiungere 75 ml di MEM freddo nella sospensione cellulare risultante. Dopo pipettaggio dolce, filtrato attraverso un colino cellulare (100 micron) per rimuovere i tessuti connettivi e frammenti di tessuto non digerito. Trasferire il filtrato in provette da 50 ml e centrifugare a 50 xg per 1 minuto a 4 ° C (freno off). Eliminare attentamente il supernatante. Risospendere il pellet con MEM freddo. Ripetere 2,4) tre volte. 3. Misti Cultura primaria delle cellule del fegato Sospendere le cellule ottenute in 2.5) nel mezzo di crescita composto da DMEM contenente 10% FCS inattivato con il calore, integrato con 100 mM β-mercaptoetanolo, 10 mg / ml di insulina, 100 mg / ml di streptomicina e 100 U / ml di penicillina, e di semi in 09:55 tessuto fiaschi cultura (superficie: 75 cm 2) ad una densità di 6,7 x 10 4 cellule / cm 2 (5 x 10 6 cellule / fiasco / 12 -15 ml di terreno). Incubare la cultura flasksat 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria. Sostituire il mezzo di coltura ogni 2 o 3 intervalli di giorni. 4. Isolamento selettivo dei macrofagi Dopo 12 giorni di coltura, i macrofagi proliferano sul foglio delle cellule. Queste cellule sono sospese dalle reciproche agitazione dei flaconi cultura a 80-120 colpi al minuto per 30 minuti a 37 ° C. Trasferire il terreno di coltura in 100 mm non tessuto cultura piatti di qualità plastica. Piscina del mezzo da due T75 fiaschi in un piatto di plastica. Fiaschi cultura riempire con il mezzo di crescita e li riporta ai incubatrice. Incubare piatti di plastica per 30 minuti a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria. Macrofagi prontamente attribuiscono alla non-tessuti piatti di plastica di qualità della cultura in questo processo di incubazione, mentre altre cellule contaminanti non lo fanno. Aspirare il mezzo e risciacquare delicatamente il piatto di plastica con PBS. Ripetere questa operazione tre volte. Aggiungere 1 ml di soluzione TrypLE espresso nel piatto, e incubare per 10 minuti a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria. Aggiungere 9 ml del mezzo di crescita. Delicatamente togliere la macrofagi attaccato da un raschietto cellula. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 min a 25 ° C (freno). Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml del mezzo di crescita. Dissociano in singole cellule pipettando vigoroso. Enumerare il numero di cellulare da un emocitometro conteggio. Passaggi di isolamento può essere ripetuto con la stessa cultura fiaschi a intervalli di 2-3 giorni per più di due settimane. Macrofagi isolati possono essere coltivate in terreno di coltura cui al punto 3.1. 5. Rappresentante Risultati Un esempio di una coltura mista primaria di cellule adulte fegato di ratto è illustrato nella figura 2. Epatociti parenchimale perdere la morfologia delle cellule epiteliali in pochi giorni di cultura, degeneri o si trasformano in fibroblasto-come le cellule.Poi, intorno al giorno 6 a 12, a contrasto di fase-brillante, tondo macrofago-come le cellule proliferano vigourouly sul foglio cellulare fibroblastica. Agitando dei flaconi cultura, i macrofagi sono prontamente sospese nel terreno di coltura, e il successivo trasferimento e l'incubazione in piatti di plastica risultato in adesione selettiva dei macrofagi (Figura 3). Il macrofago-come le cellule possono essere raccolte fin dal giorno 8, e il numero ha raggiunto livelli massimi nei giorni 12 a 14. Più di 10 6 cellule possono essere raccolte da un pallone T75 cultura ripetutamente da 2 a intervalli di 3 al giorno per più di due settimane, consentendo un rendimento totale di cellule per bombola del 10 7 al T75 fiasco cultura (Figura 3). La purezza dei macrofagi isolati sono stati del 95 al 99%, come valutato da flowcytometry o immunocitochimica con ratto macrofagi anticorpi specifici, come ED-1 (Figura 4), ​​ED-3, OX-41 (Figura 4) e Iba1 9. Le cellule isolate mostrano caratteristiche tipiche dei macrofagi, come la fagocitosi attiva di perline polystylene (Figura 5), la risposta proliferativa a ricombinante GM-CSF, la secrezione di infiammatorio / citochine antinfiammatorie sulla stimolazione con LPS, e la formazione di cellule giganti multinucleate 9. Figura 1. Un sistema per l'isolamento e la purificazione dei macrofagi come cellule miste colture primarie di cellule di fegato di ratto. Figura 2. Colture primarie di cellule di fegato di ratto e la proliferazione dei macrofagi come cellule. Freccia indica una cella multinucleare gigante. Barra di scala = 100 micron. Ristampato dalla Gazzetta di metodi immunologici, Vol.360, 47-55 (2010) 9 con il permesso di Elsevier. Figura 3. Isolamento selettivo di macrofagi come le cellule dalle scosse e il metodo di fissaggio. Le cellule sono state sospese nel terreno di coltura agitando i palloni, successivamente trasferito in non-tessuto piatti di plastica cultura grado, e incubate a 37 ° C. Già 10 minuti dopo la placcatura, macrofagi come le cellule attaccate alla superficie piatto, mentre altre cellule contaminanti fibroblastica è rimasta in sospeso. Dopo il risciacquo con PBS, una popolazione di macrofagi altamente purificato è stato ottenuto. Queste cellule guadagnato morfologia tipica dei macrofagi dopo 40 min di cultura e cellule mitotiche sono stati osservati frequentemente (frecce). Successive modifiche del numero delle cellule recuperato palloni in periodi di diversa cultura sono mostrati. I valori sono una media ± SD 3-5 fiaschi. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte ed i dati sono indicate da simboli diversi. Barra di scala = 100 micron. Ristampato dalla Gazzetta di metodi immunologici, Vol.360, 47-55 (2010) 9 con il permesso di Elsevier. Figura 4. Colorazione immunocitochimica dei macrofagi come cellule con anticorpi monoclonali contro macrofagi di ratto. Figura 5. Fagocitosi di marcato con FITC microsfere da macrofagi come cellule.