Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

1. Preparación de tumorspheres retinoblastoma Obtener una muestra del tumor retinoblastoma en un protocolo aprobado por el IRB. Prepare frescos define los medios de comunicación de células madre (Neurobasal-A los medios de comunicación, 1X suplemento de B-27 menos de vitamina A, 1X no esenciales solución de aminoácidos, 1X L-glutamina, 20 ng / mL FEAG, 10 ng / mL bFGF). Mecánicamente desglosar el tejido del tumor con un bisturí con una técnica transversal de un tejido estéril, la cultura tratados con 6-así placa. Inmediatamente añadir 100 ml de definir los medios de comunicación de las células madre en el tejido suave y difusión del tejido picado con el bisturí. Añadir 5 ml de definir los medios de comunicación de las células madre para el bienestar. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 en un incubador humidificado e inspeccionar todos los días. Algunos tumorspheres debe surgir a partir del tejido del tumor interrumpe casi de inmediato, con un número creciente en el transcurso de 2-4 días. Semanales, tumorspheres centrifugar a 300xg durante 5 minutos, volver a suspender en recién preparada define los medios de comunicación de las células madre, y la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces para interrumpir el más grande, las esferas central necrótica y permitir que nuevos ámbitos, sana a la forma. 2. Preparación de las células tumorales para la inyección Si se inyectan tumorspheres cultivadas, con cuidado las esferas de la pipeta en un tubo cónico de 15 ml. Pipeta suavemente hacia arriba y abajo con una pipeta serológica 10-15 veces para interrumpir las esferas. Contar las células que se inyecta con una hemocitómetro, y alícuota al menos 50.000 células por inyección en un nuevo tubo. Prepárese para las inyecciones como sea posible en función del número de células disponibles. Centrifugar a 300xg durante 5 minutos. Con cuidado, aspirar el sobrenadante y resuspender en 5 ml de PBS. Repetir la centrifugación y la aspiración, y resuspender en 10 l de PBS por inyección. 3. Preparación de los animales Utilizando una jeringa de insulina, administrar una inyección intraperitoneal de cóctel roedores anestesia (ketamina 37,6 mg / ml, la xilazina 1,92 mg / mL, acepromacina 0,38 mg / ml) a un l por gramo de peso corporal (GBW). Espere 5 minutos para que el animal se sedado. Comprobar el latido del corazón y el lugar del animal en un cojín de calefacción. Mantener los animales en un cojín de calefacción en todo momento hasta su recuperación. Después de la sedación, administrar una gota de HCl proparacaína en el ojo derecho. Vuelva a colocar los animales en el teclado se calienta y esperar 1 minuto. Administrar una gota de fenilefrina HCl en el ojo derecho. Vuelva a colocar el animal en el teclado se calienta y espere 5 minutos. Si la dilatación de la pupila no ha ocurrido, volver a administrar una gota y esperar otros 5 minutos. Observar a los animales para detectar signos de movimiento o contracción muscular, que puede ocurrir en> 30 minutos después de la sedación. Ante los primeros síntomas de movimiento, administrar 1 l / gbw de ketamina HCl (diluida a 10 mg / ml en PBS) y espere 5 minutos. 4. La inyección de células tumorales Coloque el animal anestesiado bajo el microscopio de su lado, con el ojo derecho hacia arriba y con la cabeza apoyada sobre una gasa y se centra en obtener un reflejo rojo en el ojo derecho del fondo de ojo (pupila debe ser dilatada en este momento) cuando se observa a través del microscopio . Sostener el globo ocular derecho presionando suavemente al mismo tiempo con dos dedos sobre los párpados y mantener esta posición de manera constante durante el resto del procedimiento. Utilizando una aguja estéril de calibre 30 aguja conectada a una jeringa Luer-lock, perforar el globo lateralmente a través de la conjuntiva y la esclera adyacente al limbo corneal en el área de la pars plana (Figura 1) y sólo a través de la coroides en la cavidad vítrea. Retire la aguja de la apertura. Esterilizar la aguja Hamilton con un algodón con alcohol. Dibuja la suspensión de células en la jeringa Hamilton e inserte la aguja en el orificio hasta que la aguja se visualiza a través del microscopio detrás de la cámara en el vítreo, cerca de la retina. Con la ayuda de una segunda persona mientras se mantiene la aguja de manera constante en esta posición, presione el émbolo lenta. Retire la aguja. Si es necesario, use un hisopo de algodón para absorber cualquier líquido de la apertura. Suavemente liberar la presión de los párpados para cerrar los párpados del ratón. Administrar una gota de hipromelosa para cada ojo y devolver los animales al cojín calentado para la recuperación. 5. Seguimiento de los ratones inyectados y la cosecha de los tumores Todos los días, examinará los ojos inyectados de leucocoria (reflejo blanco papilar) y / o distensión periocular que por lo general se manifiesta 2-4 semanas después de la inyección. Una vez que el crecimiento del tumor se detecta, la eutanasia de animales de acuerdo con las directrices institucionales. Si el ojo y el tumor está cubierto por los párpados, el uso del bisturí para realizar dos incisiones ortogonal a la hendidura palpebral y levantar los colgajos de piel. Bajo visualización con el microscopio estereoscópico, hacer una incisión circunferencial en el limbo, la eliminación de la córnea y el cristalino, y con mucho cuidado diseccionar la mayor parte de la masa del tumor de los tejidos con otros tweezers. Lugar del tumor en estéril RPMI-1640. Utilizar pinzas para extraer lentamente el mundo abierto de la toma. Para asegurar un nervio óptico adjunto para la invasión del tumor se pueden visualizar, tire del mundo hasta que el nervio está expuesto y el uso de tijeras para cortar el nervio mayor tiempo posible. Lugar en formol al 10% para el procesamiento normal para el examen histológico. 6. Los resultados representativos: Tumorspheres retinoblastoma comenzarán a aparecer a partir del tejido desglosados ​​casi de inmediato, ya que se liberan de la masa tumoral. Dentro de 2-4 días, más tumorspheres se empiezan a formar y aumentar de tamaño. Las esferas tienden a ser regulares y presentan una estrategia bien definida, la membrana que rodea el conjunto secundario (Figura 2). El animal se presenta típicamente con leucocoria en las 4 semanas después de la inyección (Figura 3b), seguido por la ampliación de la tierra y la distensión de los tejidos circundantes 5-8 semanas después de la inyección al crecer el tumor (Figura 3c). Figura 1. Transversal diagrama del ojo del ratón destacando características mencionadas en el protocolo. Figura 2. Cultivo de células humanas in vitro retinoblastoma imágenes en un 4x), y b) aumento del objetivo de 10x. Células de retinoblastoma tumor primario producir tumorspheres con una forma regular esferoide y una membrana externa crujiente. Las barras de escala representan a) 500 m, y b) micras 200. Figura 3 Ojo de Rag2 -. / – Ratón que muestra una serie de características) normal, b) indicativo de una masa tumoral en la cavidad vítrea leucocoria, y c) una gran masa tumoral de llenar el mundo con distensión periocular asociada, hemorragia intraocular.