Создание и распространение опухолей человека Ретинобластома в иммунодефицитных мышей

1. Подготовка ретинобластома tumorspheres Получить образец ретинобластома опухоли под IRB, утвержденных протоколом. Подготовка свежих определены СМИ стволовых клеток (Neurobasal-медиа, 1X B-27 дополнения минус витамина, 1X несущественные аминокислоты кислоты, 1X L-глутамина, 20 нг / мл ЭФР, 10 нг / мл bFGF). Механически дезагрегировать опухолевой ткани с помощью скальпеля использованием сквозной технику в стерильной, культуры тканей обработанных 6-луночный планшет. Сразу же добавить 100 мкл определены СМИ стволовых клеток в ткани и мягко распространению фарш ткани с помощью скальпеля. Добавьте 5 мл определены СМИ стволовых клеток к колодцу. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 во влажной инкубатор и проверить ежедневно. Некоторые tumorspheres должны вытекать из опухолевой ткани нарушается почти сразу, и все больше в течение 2-4 дней. Еженедельно, центрифуги tumorspheres на 300xg в течение 5 минут, ресуспендируют в свежеприготовленный определены СМИ стволовых клеток, и пипетки вверх-вниз 10 раз, чтобы сорвать больше, централизованно некротических сферах, а также позволяет новым, здоровым сфер форме. 2. Подготовка опухолевых клеток для инъекций Если инъекционных культурный tumorspheres, мягко пипетки сферы в 15-мл коническую трубку. Аккуратно пипетки вверх и вниз с серологические пипетки 10-15 раз сорвать сферах. Граф клетки для инъекций использованием hemacytometer, и аликвоту не менее 50000 клеток на введение в новую трубу. Подготовка к инъекции, как многие, как возможно на основе числа клеток имеется. Центрифуга на 300xg течение 5 минут. Тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют в 5 мл PBS. Повторите центрифугирования и стремление, и ресуспендируют в 10 мкл PBS на инъекцию. 3. Подготовка животных Использование инсулиновый шприц, администрирования при введении препарата в грызун коктейль анестезии (кетамин 37,6 мг / мл, ксилазина 1,92 мг / мл, acepromazine 0,38 мг / мл) на 1 мкл на грамм массы тела (GBW). Подождите 5 минут, чтобы животное могло стать седации. Проверьте пульс и место животного на нагретой панели. Поддерживать животных на нагревают площадку в любое время до выздоровления. После седации, администрирования 1 каплю раствора для proparacaine правого глаза. Замените животные на подогреваемых блокнот и подождите 1 минуту. Администрирование 1 каплю раствора для фенилэфрин правого глаза. Замените животные на площадке подогревом и подождать 5 минут. Если расширение зрачка не произошло, повторно управлять 1 капли и подождать еще 5 минут. Монитор животных на наличие признаков движения или подергивания, которые могут возникнуть на> 30 минут после успокоения. При первых признаках движения, управление 1 мкл / GBW кетамина HCl (разбавляют до 10 мг / мл в PBS) и подождите 5 минут. 4. Инъекции клеток опухоли Место под наркозом животных под микроскопом на боку, с правого глаза вверх и с голову на марлю и в центре, чтобы получить красный рефлекс глазного дна правого глаза (ученик должен быть расширенными в это время), когда наблюдается через микроскоп . Подоприте право мира, осторожно надавив одновременно с двумя пальцами на веки и держать эту позицию уверенно на оставшуюся часть процедуры. Использование стерильных 30-игла прилагается к Луер-Лок шприц, проколоть миру сбоку через конъюнктивы и склеры, прилегающих к роговице лимба в районе Парс-Плана (рис. 1) и только через сосудистую оболочку в полость стекловидного тела. Удалите иглу из отверстия. Стерилизуйте иглу Гамильтона с тампоном, смоченным спиртом. Нарисуйте клеточной суспензии в шприц Гамильтон и вставить иглу в отверстие до иглы визуализируется через микроскоп за линзы в стекловидное возле сетчатки. С помощью второго человека, держа иглу постоянно в этом положении, нажмите поршень медленно. Удалите иглу. Если необходимо, используйте ватный тампон, чтобы поглощать жидкости из отверстия. Аккуратно релиз давлением веки, чтобы закрыть мыши веки. Администрирование 1 каплю гипромеллоза для каждого глаза и вернуть животное подогревом площадкой для восстановления. 5. Мониторинг вводили мышам и уборки опухолей Ежедневно, изучить вводят око за leukocoria (белые папиллярные рефлекс) и / или periocular вздутие, которое обычно проявляется через 2-4 недели после инъекции. Как только рост опухолей обнаружен, эвтаназии животных в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Если глаза и опухоль распространяется век, использовать скальпель, чтобы сделать два разреза ортогональной глазной щели и поднимите кожных лоскутов. Под визуализации с помощью стереоскопического микроскопа, делают разрез в окружной лимба, удаление роговицы и хрусталика, и тщательно анализировать основную часть опухоли из других тканей с использованием TweeЦерс. Место опухоли в стерильной среде RPMI-1640 средств массовой информации. Используйте пинцет, чтобы медленно потяните открытым миру из розетки. Для обеспечения прилагается зрительного нерва так опухолевой инвазии могут быть визуализированы, тянуть шар до нерва подвергается и использовать ножницы, чтобы вырезать нерва как можно дольше. Место в 10% формалине для регулярной обработки для гистологического исследования. 6. Представитель Результаты: Ретинобластома tumorspheres начнут появляться с разбивкой ткань практически сразу же, как они будут освобождены от опухоли. В течение 2-4 дней, более tumorspheres начнет формировать и будет увеличиваться в размерах. Сферах, как правило, регулярные и имеют четко определенного, среднего мембраны, окружающей агрегат (рис. 2). Животного обычно проявляется leukocoria в течение 4 недель после инъекции (рис. 3б), а затем расширение земной шар и растяжения окружающих тканей через 5-8 недель после инъекции, как опухоль растет (рис. 3в). Рисунок 1. Поперечного сечения диаграммы мыши глаз подсветка функции, указанные в протоколе. Рисунок 2. Культуры человеческих клеток в пробирке ретинобластома отображаеются) 4x, и б) 10-кратным увеличением цели. Ретинобластома первичные опухолевые клетки производят tumorspheres с регулярной сфероида форму и четкие наружной мембраны. Шкала бары представляют) 500 мкм, и б) 200 мкм. Рисунок 3 Глаз RAG2 -. / – Мыши показывает) нормальные функции, б) leukocoria свидетельствует о опухолевой массы в полость стекловидного тела, и в) большая масса опухоли заполнения миру с соответствующими растяжение periocular, внутриглазное кровотечение.