Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

1. De voorbereiding van retinoblastoom tumorspheres Verkrijgen van retinoblastoom tumor monster onder een IRB-goedgekeurde protocol. Bereid verse gedefinieerd stamcellen media (Neurobasal-A media, 1X B-27 supplement minus vitamine A, 1X niet-essentieel aminozuur oplossing, 1X L-glutamine, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF). Mechanisch disaggregeren het tumorweefsel met een scalpel met behulp van een cross-cutting techniek in een steriele, weefselkweek behandelde 6-well plaat. Onmiddellijk toevoegen 100 pi van toegezegd-stamcellen media om het weefsel en voorzichtig verspreiden het gehakt weefsel met behulp van de scalpel. Voeg 5 ml van de gedefinieerde stamcellen media naar de put. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 in een bevochtigde incubator en inspecteer dagelijks. Sommige tumorspheres moet voortkomen uit de verstoorde tumorweefsel vrijwel direct, met toenemende aantallen in de loop van 2-4 dagen. Wekelijks, centrifuge tumorspheres op 300xg gedurende 5 minuten, opnieuw in suspensie in vers bereide gedefinieerd stamcel media, en de pipet op en neer 10 keer naar grotere, centraal necrotische bollen verstoren en maken nieuwe, gezonde bollen te vormen. 2. Voorbereiding van de tumorcellen voor injectie Als het injecteren van gekweekte tumorspheres, zacht pipet bollen in een 15-mL conische buis. Voorzichtig pipet op en neer met een serologische pipet 10-15 keer naar de sferen te verstoren. Tel de cellen worden geïnjecteerd met behulp van een hemacytometer en hoeveelheid ten minste 50.000 cellen per injectie in een nieuwe buis. Bereid je voor op zo veel injecties als mogelijk op basis van het aantal cellen beschikbaar. Centrifugeer bij 300xg gedurende 5 minuten. Voorzichtig het supernatans aspireren en resuspendeer in 5 ml PBS. Herhalen centrifugeren en aspiratie, en resuspendeer in 10 pi PBS per injectie. 3. Voorbereiding van de dieren Met behulp van een insulinespuit, toedienen een intraperitoneale injectie van knaagdier anesthesie cocktail (ketamine 37,6 mg / ml, xylazine 1,92 mg / ml, acepromazine 0,38 mg / ml) op een pi per gram lichaamsgewicht (GBW). 5 minuten wachten voor het dier te worden verdoofd. Controleer op hartslag en plaats het dier op een verwarmde pad. Te houden dieren op een verwarmd kussen ten alle tijden tot herstel. Na sedatie, toedienen 1 druppel proparacaine HCl aan het rechter oog. Vervanging van dier op verwarmde pad en wacht 1 minuut. Dien een druppel fenylefrine HCl aan het rechter oog. Vervang het dier op het verwarmde pad en wacht 5 minuten. Als de dilatatie van de leerling niet heeft plaatsgevonden, opnieuw beheren een druppel en wacht nog 5 minuten. Monitor dieren tekenen van beweging of trillen, die zich kunnen voordoen bij> 30 minuten na sedatie. Bij de eerste tekenen van beweging, beheren een pL / GBW van ketamine HCl (verdund tot 10 mg / ml in PBS) en wacht 5 minuten. 4. Injectie van tumorcellen Plaats de verdoofde dier onder de microscoop op zijn kant, met het rechter oog naar boven en met het hoofd rustend op gaas en gecentreerd om een ​​rode reflex van het rechter oog fundus (pupil verwijd moet worden op dit moment) te verkrijgen bij de waargenomen door de microscoop . Het faillissement van de juiste wereld door voorzichtig naar beneden te duwen gelijktijdig met twee vingers op de oogleden en gestaag houdt deze positie voor de rest van de procedure. Met behulp van een steriele 30-gauge naald bevestigd aan een Luer-lock spuit, de hele wereld doorboren zijwaarts door het bindvlies en sclera grenzend aan de corneale limbus op het gebied van de pars plana (figuur 1) en alleen via de vaatvlies in het glasvocht holte. Verwijder de naald uit de opening. Steriliseer de Hamilton naald met een alcoholdoekje. Teken de celsuspensie in de Hamilton spuit en steek de naald in de opening totdat de naald wordt gevisualiseerd door de microscoop achter de lens in het glasvocht in de buurt van het netvlies. Met de hulp van een tweede persoon terwijl de naald steeds in deze positie, druk de zuiger langzaam. Verwijder de naald. Indien nodig, gebruik dan een wattenstaafje om vocht te absorberen uit de opening. Voorzichtig de druk van de oogleden naar de muis oogleden te sluiten. Dien een druppel hypromellose aan elk oog en terug te keren dier verwarmde pad voor herstel. 5. Controle van de geïnjecteerde muizen en het oogsten van tumoren Dagelijks, onderzoekt de geïnjecteerde oog voor leukocoria (wit papillair reflex) en / of perioculaire distensie die meestal duidelijk wordt 2-4 weken na de injectie. Zodra groei van de tumor wordt ontdekt, euthanaseren van dieren volgens de institutionele richtlijnen. Als het oog en de tumor worden gedekt door de oogleden, gebruik dan de scalpel om twee incisies loodrecht op de ooglidspleet te maken en de huid flappen lift. Onder visualisatie met behulp van de stereoscopische microscoop, maak een omtrek incisie aan de limbus, het verwijderen van het hoornvlies en de lens, en zorgvuldig het grootste deel van de tumormassa ontleden van de andere weefsels met behulp van Tweezers. Plaats de tumor in steriele RPMI-1640 media. Gebruik een pincet om de open wereld langzaam te trekken uit het stopcontact. Om ervoor te zorgen een aangesloten oogzenuw, zodat tumor invasie kan worden gevisualiseerd, trekt de hele wereld tot de zenuw wordt blootgesteld en het gebruik van een schaar om de zenuw snijden zo lang mogelijk. Plaats in 10% formaline voor gewone verwerking voor histologisch onderzoek. 6. Representatieve resultaten: Retinoblastoom tumorspheres zal beginnen te blijken uit de gedesaggregeerde weefsel bijna onmiddellijk als ze zijn bevrijd van de tumormassa. Binnen 2-4 dagen zal er meer tumorspheres beginnen te vormen en zal in omvang toenemen. De bollen hebben de neiging om regelmatig zijn en in een goed gedefinieerde, secundaire membraan rond de totale (figuur 2) vertonen. Het dier meestal presenteert met leukocoria binnen 4 weken na de injectie (figuur 3b), gevolgd door de uitbreiding van de aardbol en uitzetting van de omliggende weefsels 5-8 weken na de injectie als de tumor groeit (figuur 3c). Figuur 1. Cross-doorsnede van de muis oog markering functies waarnaar in het protocol. Figuur 2. Cultuur van menselijke retinoblastoom cellen in vitro afgebeeld op: a) 4x, en b) 10x objectiefvergroting. Retinoblastoom primaire tumor cellen produceren tumorspheres met een regelmatige sferoïde vorm en een heldere buitenste membraan. Schaal staven geven een) 500 micrometer, en b) 200 micrometer. Figuur 3 Eye of Rag2 -. / – Muis met een) normale functies, b) leukocoria indicatie van een tumor massa in glasachtig holte, en c) een grote tumormassa het vullen van de hele wereld met de bijbehorende perioculaire buik, intraoculaire bloeding.