Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

1. Retinoblastom tumorspheres hazırlanması TC Sağlık Bakanlığı onaylı protokol kapsamında retinoblastom tümör örnek alın. Taze tanımlanmış kök hücre ortamı hazırlayın (Neurobasal-medya, 1X B-27 takviyesi eksi A vitamini, 1X elzem olmayan bir amino asit çözeltisi, 1X L-glutamin, 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF). Steril bir, dokuda bir çapraz kesim tekniği kullanarak bir neşter kültür-tedavi 6-plaka ile tümör dokusu mekanik parçalara ayırma. Hemen doku tanımlanmış kök hücre medya 100 mcL ekleyin ve hafifçe neşter kullanılarak kıyılmış doku yayıldı. Iyi tanımlanmış kök hücre medya 5 ml ekleyin. 37 ° ° C'de,% 5 ile nemlendirilmiş bir inkübatör CO 2 ve günlük olarak kontrol edin . Bazı tumorspheres 2-4 gün içerisinde giderek artan sayıda, hemen bozulur tümör dokusu ortaya çıkmalıdır. Haftalık 300xg az 5 dakika santrifüj tumorspheres, taze hazırlanmış tanımlanmış kök hücre medyada tekrar süspansiyon ve pipetlemeyin yukarı ve aşağı 10 kat daha büyük, merkezi nekrotik küreler bozabilir ve yeni, sağlıklı bir küre oluşturacak şekilde izin vermek. 2. Tümör hücrelerinin enjeksiyon için hazırlanması Eğer 15-ml konik bir tüp içine yavaşça kültürlü tumorspheres, pipetlemeyin küreler enjekte. Serolojik pipetlemeyin küreler bozmaya 10-15 kez yavaşça pipetlemeyin yukarı ve aşağı. Hücreleri saymak bir hemasitometre ve kısım enjeksiyon başına en az 50.000 hücreleri kullanarak yeni bir tüp içine enjekte edilir. Kullanılabilir hücre sayısı mümkün olduğunca çok sayıda enjeksiyonlar için hazırlayın. 5 dakika 300xg santrifüjleyin. 5 ml PBS dikkatlice supernatant ve tekrar süspansiyon aspirat. Santrifüj ve aspirasyon tekrarlayın ve enjeksiyon başına 10 mcL PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 3. Hayvanların hazırlanması Bir insülin enjektörü kullanarak, kemirgen anestezi kokteyl intraperitoneal (ketamin 37.6 mg / ml, ksilizin 1.92 mg / ml, acepromazine 0.38 mg / ml) gram vücut ağırlığı başına 1 mcL (GBW). Yönetmek Sedasyon olmak için hayvan için 5 dakika bekleyin. Kalp atışı olup olmadığını kontrol edin ve hayvan ısıtılmış bir yastık yerleştirin. Kurtarma kadar her zaman ısıtılmış bir pad üzerinde hayvanları koruyun. Sedasyon sonra, sağ göz proparacaine HCl 1 damla yönetmek. Isıtmalı pad üzerinde hayvan değiştirin ve 1 dakika bekleyin. Sağ göz HCl fenilefrin 1 damla yönetin. Isıtılmış pad üzerinde hayvan değiştirin ve 5 dakika bekleyin. Pupilla dilatasyonu oluştu varsa, 1 damla yeniden yönetmek ve başka bir 5 dakika bekleyin. > 30 dakika sonrası sedasyon oluşabilir, hareket ya da seğirmesi işaretleri, hayvan izleyin. Hareketin ilk işaretleri, 1 mcL / GBW ketamin HCl (10 mg / ml PBS içinde seyreltilmiş) yönetmek ve 5 dakika bekleyin. 4. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu Yukarı bakacak şekilde sağ göz ve baş gazlı bez üzerine oturtulmuş ve mikroskop ile gözlenen sağ göz fundus (öğrenci şu anda dilate edilmelidir) kırmızı bir refleks elde etmek için merkezli, kendi tarafında mikroskop altında anestezi hayvan koyun . Hafifçe göz kapaklarınızın üzerinde iki parmak ile aynı anda aşağı iterek ve prosedürün geri kalanı için sürekli bu konumda tutun, sağ kürenin Prop. Delmek pars plana alan kornea limbus bitişik konjonktiva ve sklera (Şekil 1) ve vitreus boşluğuna koroid yanal, Luer-lock şırınga bağlı steril bir dünya kullanarak 30-gauge iğne. Açılış iğne çıkarın. Hamilton iğnesi bir alkollü bez ile sterilize edin. Hamilton enjektöre hücre süspansiyonu çizin ve iğne iğne merceğin arkasında retinanın yakınındaki vitreus mikroskop aracılığıyla görülünceye kadar ağzına takın. Bu pozisyonda sürekli iğne tutarken ikinci bir kişinin yardımı ile, piston yavaşça bastırın. İğneyi çıkarın. Gerekirse, açılışından itibaren herhangi bir sıvı absorbe etmek için bir pamuklu bir bez kullanın. Fare göz kapaklarını kapatmak için göz kapaklarının basıncı yavaşça bırakın. Her bir göze 1 damla Hipromellöz Yönetici ve kurtarma için ısıtmalı yastık hayvan dönmek. 5. Enjekte edilen farelerin tümörler hasadı ve İzlenmesi Günlük, genellikle 2-4 hafta enjeksiyon sonrası belirgin hale gelir enjekte leukocoria için göz (beyaz papiller refleks) ve / veya perioküler distansiyon inceleyin. Tümör büyümesi hayvan kurumsal kurallarına göre, euthanize algılanır. Göz ve tümör göz kapaklarının kaplı ise, palpebral fissür dik iki kesiler yapmak ve cilt flep kaldırma neşter kullanabilirsiniz. Stereoskopik mikroskop kullanarak görüntüleme altında, kornea ve lens çıkarmadan, limbus dairesel kesi yapmak ve dikkatle twee kullanarak diğer dokularda tümör kitlesi toplu teşrihzers. Steril RPMI-1640 medya tümör yerleştirin. Açık küre, yavaş yavaş prizden çekmek için cımbız kullanın. Ekli bir optik sinir tümör invazyonu görüntülenmiştir böylece sağlamak için, sinir maruz kadar dünyanın çekin ve mümkün olduğunca uzun süre sinir kesmek için makas kullanın. Histolojik muayene için düzenli olarak işlenmesi için% 10 formalin yerleştirin. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Retinoblastom tumorspheres hemen tümör kitlesi kurtuldu olarak ayrıştırılmış doku görünmeye başlayacaktır. 2-4 gün içinde, daha tumorspheres formu ve boyutu artacak başlayacak. Küreler, düzenli ve agrega (Şekil 2) çevreleyen iyi tanımlanmış, ikincil membran sergilemek eğilimindedir. Hayvan genellikle dünya ve tümör büyüdükçe enjeksiyonu 5-8 hafta sonra çevre dokulara distansiyon genişleme, enjeksiyon sonrası (Şekil 3b) 4 hafta içinde leukocoria ile sunar (Şekil 3c). Şekil 1 protokol başvurulan özellikleri vurgulayarak fare göz kesit diyagramı. Şekil 2 a) 4x in vitro insan retinoblastom hücrelerinin Kültür görüntülü ve b) objektif 10x büyütme. Retinoblastom primer tümör hücrelerinin düzenli bir sfero şekil ve net bir dış zar ile tumorspheres üretir. Ölçek bar a) 500 mikron temsil eder, b) 200 mikron . Şekil 3. Göz Rag2 – / -, b) normal özellikleri gösteren fare) vitreusa bir tümör kitlesi göstergesidir leukocoria, ve c) büyük bir tümör kitlesi dünya ilişkili perioküler distansiyon, göz içi kanama ile doldurma.