تلفيق Micropatterned الهلاميات المائية لأنظمة الثقافة العصبية الديناميكية باستخدام الطباعة التصويرية إسقاط القناع
Summary
موصوفة تقنيات بسيطة لإنتاج أنظمة السريع لmicrofabricated ثقافة العصبية باستخدام جهاز رقمي لديناميكية micromirror قناع الطباعة الحجرية الإسقاط على ركائز الثقافة العادية الخلية. قد تكون هذه النظم ثقافة تكون أكثر تمثيلا للهندسة البيولوجية الطبيعية ، ويمكن تكييف التقنيات وصف للعديد من التطبيقات.
Abstract
على نحو متزايد ، منقوشة بيئات زراعة الخلايا أصبحت تقنية ذات الصلة لدراسة الخصائص الخلوية ، والعديد من الباحثين يعتقدون في حاجة لبيئات 3D تمثل في التجارب المختبرية التي تحاكي أفضل في الصفات المجراة 1-3. وقد أظهرت الدراسات في مجالات مثل أبحاث السرطان 4 ، 5 الهندسة العصبية والقلبية الفيزيولوجيا 6 ، والتفاعل خلية مصفوفة 7،8 سلوك الخلية تختلف اختلافا كبيرا بين الثقافات التقليدية ويبني أحادي الطبقة 3d.
وتستخدم الهلاميات المائية والبيئات 3D بسبب مرونتها والتنوع والقدرة على التركيب الجزيئي ترزي خلال functionalization 12/09. العديد من التقنيات المتبعة لإنشاء بنيات والخلية الداعمة للمصفوفات ، بما في ذلك electrospinning 13 ، طوابع الاستومر 14 ، 15 الطباعة النافثة للحبر ، photopatterning المضافة 16 ، الإسقاط الضوئية الرئيسية ثابتة الطباعة الحجرية – 17 ، ودينامية microstereolithography قناع 18. للأسف ، هذه الأساليب تشمل عدة خطوات الإنتاج و / أو المعدات التي لا قدرة على التكيف بسهولة إلى الخلية التقليدية وطرق زراعة الأنسجة. التقنية المستخدمة في هذا البروتوكول تتكيف مع هذا الأخير طريقتين ، وذلك باستخدام جهاز micromirror الرقمية (DMD) لإنشاء (Photomask) الزجاجية دينامية محددة للهندسيا يشابك الهلاميات المائية (PEG) بولي (جلايكول الإثيلين) ، الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية من خلال البلمرة الراديكالية الحرة بدأت. في "2.5D" الناتجة هياكل توفير بيئة مقيدة 3D للنمو العصبي. علينا اتباع نهج هيدروجيل المزدوجة ، حيث PEG بمثابة هيكل الخلية المنطقة مقيدة للتوريد إلى هلام الذاتي تجميع خلاف ذلك ولكن لا شكل خلية تساهلا من صنع إما من Puramatrix أو agarose. العملية بسيطة وسريعة تلفيق خطوة واحدة وهو تكرار للغاية وتكييفها بسهولة للاستخدام مع الطرق التقليدية لزراعة الخلايا وركائز.
يمكن إدراجها explants النسيج كله ، مثل العقد الجذرية الجنينية الظهري (DRG) ، في بنيات هيدروجيل مزدوج لفحوصات تجريبية مثل ثمرة neurite. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تغليف الخلايا في فصل هيدروجيل photocrosslinkable البلمرة أو ذاتية ، أو التقيد بشكل انتقائي لدعم نفاذية الغشاء الخلوي باستخدام photopatterning تقييدا. باستخدام DMD ، أنشأنا هيدروجيل يبني حتى 1MM ~ سميكة ، ولكن رقيقة (<200 ميكرون) كانت محدودة هياكل الربط بواسطة التبريد الأكسجين للتفاعل البلمرة الراديكالية الحرة. بعد ذلك قمنا بتطوير تقنية الاستفادة من وجود طبقة من النفط فوق السائل الذي سمح البلمرة بلمرة رقيقة بنية الربط.
في هذا البروتوكول ، ونحن تصف خلق السريع للنظم هيدروجيل 3D لإنتاج الخلايا العصبية microfabricated والثقافات الأنسجة. ويبني هيدروجيل أثبتت المزدوج هنا تمثل تنوعا في النماذج المختبرية التي قد تكون مفيدة للدراسات في علم الأعصاب التي تنطوي على بقاء الخلية ، والهجرة ، و / أو النمو neurite والتوجيه. وعلاوة على ذلك ، كما يمكن أن تعمل على بروتوكول لكثير من أنواع الخلايا والهلاميات المائية ، والتطبيقات المحتملة على حد سواء متنوعة واسعة.
Protocol
Discussion
ويمكن استخدام الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة من قبل أي محقق تسعى بسيطة وقابلة للتكرار نظم ثقافة الخلية. نظريا ، ويرجع ذلك إلى مجموعة واسعة من الهلاميات المائية المتاحة photopolymerizable ، يمكن تكييف البيئة للسماح للاستخدام مع أي نوع من الخلايا ، بما في ذلك explants النسيج كله. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النظام المزدوج هيدروجيل تسمح للسيطرة المكانية تحسن في عرض الهلاميات المائية المصير البلمرة ، والتي تميل لتشكيل الأشكال غير متبلور من تلقاء نفسها. في "2.5D" الناتجة هيدروجيل micropatterned يبني تقديم مصفوفة 3D للنمو العصبي عرضت في تكوين 2D تمكن التقييم المجهرية مريحة. ويمكن أيضا الركيزة التي يتم بلمرة المواد الهلامية تكون متنوعة ، مما يسمح لقدر أكبر من التحكم في التصميم التجريبي. هي الأمثل طرقنا للاستخدام مع خلية ثقافة تدعم نفاذة ، كما رأينا جدوى تحسين الشكل (4) مقارنة البلمرة على الشرائح الزجاجية (لا تظهر البيانات). ومع ذلك ، قد تكون السطوح البلمرة أخرى أكثر قابلية للتطبيق لتطبيقات مختلفة : تلفيق على الشرائح الزجاجية المستخدمة في التجارب على microfluidics أو تشكيلات التجميعية الخلية ، على سبيل المثال.
وقد أدت تجربتنا مع هذه النظم الثقافة لتحديد المجالات المحتملة للصعوبة. أولا ، هناك حاجة تقنيات الحذر للحفاظ على عقم ويبني. نظرا لطبيعة ضخمة من الإعداد DMD ، فمن الصعب أن تعمل الخطوات البلمرة تحت ظروف معقمة. لمكافحة هذه المشكلة ، فإن الخطوة شطف وصفها في طرق غير مفيدة ، وينبغي استخدام المضادات الحيوية في جميع وسائل الإعلام. بالإضافة إلى ذلك ، سمك النهائي وشكل بناء بلمرة تعتمد بشكل كبير على سلوك السائل من الخليط قبل البوليمر ، وجود الغضروف المفصلي يمكن أن يؤدي إلى بنيات هلام أن تكون رقيقة جدا أو غير كامل بلمرة (الشكل 6). ويمكن اتخاذ خطوتين للحد من تشكيل هلالة داخل إدراج ثقافة الخلية. لالهلاميات المائية سميكة (> 200 ميكرون) ، والطلاء بسيطة من X – المطر حول الجدار داخل إدراج كافية. ومع ذلك ، كما هو موضح أعلاه لفترة وجيزة ، ليبني رقيقة (<200 ميكرون) ، مطلوب طبقة النفط إلى كل من التقليل من هلالة وينفي تبريد الأوكسجين من البلمرة الراديكالية الحرة. ووجد القرار أن تعتمد على السمك ، مع انخفاض في حجم ميزة تتحقق مع المواد الهلامية سمكا بصورة متزايدة. القرار تباينت أيضا اعتمادا على ما إذا كان يمثل ميزة إيجابية أو سلبية الإغاثة في هيدروجيل. ومع ذلك ، حققنا القرار كافية ليبني مع أحجام ميزة الحد الأدنى على مقياس من ميكرومتر 100 ~ باستخدام المجهر أهداف فقط كما تركز البصريات.
وقد أظهرت التجارب أن لدينا ثوابت هيدروجيل المزدوج الموصوفة هنا تمثل أساسا ممتازا لتشكيل نماذج في المختبر الأساسية للنمو neurite والتوجيه. التقنية المستخدمة micropatterning هو تكييف أساليب 18،19 القائمة ، ولكن لدينا مجموعة المتابعة أكد بسيطة لتنفيذ تصميم وإنتاج الأمثل ليبني هيدروجيل المزدوج على إدراج ثقافة الخلية ؛ إدراج خلية ثقافة وحيوية لتحسين سلامة الخلية وكذلك كما يشابك حول explants الأنسجة الملتصقة سابقا. ويقتصر نطاق النتائج التي أبدتها مصالح مختبرنا ، إلا أننا نعتقد أن الأساليب المذكورة في هذا المنشور ستكون مفيدة للباحثين يبحثون عن وسيلة رخيصة وسريعة وسهلة نسبيا لاستخدامها في تصنيع خلية ثقافة 3D النماذج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الأستاذ الدكتور أنتوني مختبر Windebank لتبادل الخبرات على DRG تشريح والثقافة ، وكذلك البروفيسور تشن Shaochen لإجراء مناقشات مفيدة حول الإعداد DMD. وقد تم تمويل هذا البحث في جزء من جامعة تولين والمنح المقدمة من المجلس ولاية لويزيانا من الحكام (LEQSF [2009-10] – RD – A – 18) والمعاهد الوطنية للصحة (NS065374).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Digital Micromirror Device | Texas Instruments | DLPD4X00KIT | ||
| Collagen Coated Transwell Permeable Support | Corning | 3491 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
| Polyester Transwell Permable Support | Corning | 3412 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-036 | ||
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-164 | ||
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | ||
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
| DPBS | Invitrogen | 14190-250 | ||
| Puramatrix | BD Biosciences | 354250 | ||
| PEG 1000 | Polysciences, Inc. | 15178 | ||
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | 0298913AB | ||
| Oil | Have used both canola oil and silicon oil | Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation | ||
| OmniCure Series 1000 | Exfo | |||
| Rain-X |
References
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).
- Schindler, M. Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine. Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).
- Maltman, D. J., Przyborski, S. A. Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses. Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn’t flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).
- Irons, H. R. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).
- Bursac, N. Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties. Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Cushing, M. C., Anseth, K. S. Materials science. Hydrogel cell cultures. Science. 316, 1133-1134 (2007).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324, 59-63 (2009).
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).
- Luo, Y., Shoichet, M. S. A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration. Nature Materials. 3, 249-253 (2004).
- Wylie, R. G., Shoichet, M. S. Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel. Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).
- Ji, Y. Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds. Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).
- Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
- Xu, T. Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method. Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).
- Liu Tsang, V. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, 790-801 (2007).
- Beebe, D. J. Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).
- Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).
- Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays. Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).
