המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

1. DMD ההתקנה הלוח DMD, מדריך אור UV (עם collimator) ואת העדשה אובייקטיבי 4x מורכבים כל אנכית על השולחן בידוד רעידות. המדריך אור UV צריך להיות מותאם כך האור פוגע מערך המראה בזווית של 45 מעלות ביחס למישור של מראות, ° 24 מתחת למטוס המראות (איור 1). העדשה מטרת מותקן כך המרחק בין DMD אל העדשה אובייקטיבי המתאים אורך המוקד הקשורים העדשה. מיקרוסקופ הפוך ממוקמת מתחת העדשה אובייקטיבי, כך שהאור המוחזר מן ממוקד DMD ניתן דמיינו מבעד למיקרוסקופ. המרחק בין העדשה המטרה אל פני השטח פילמור יש כ מתאימות מרחק העבודה של העדשה. השלב על המיקרוסקופ לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכוון את המרחק עד דק למקד את התמונה. מרחק זה עשוי להשתנות בהתאם על פני השטח פילמור הנבחר. 2. Hydrogel בונה כפול עבור תרבויות Explant רקמות א DRG הידבקות explant מעיל קירות מצופים היטב 6-קולגן תא מוסיף תרבות (קורנינג) עם ה-X גשם, מקפיד להימנע קרום עצמו. (לחלופין, עט חיץ הידרופובי ניתן להשתמש.) מוסיף מימה לילה עם 1.5 מ"ל של מדיום הידבקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2. המדיום הוא מדיום הדבקה neurobasal עם סרום 10% שור עוברית, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 0.5mm L-גלוטמין ו -20 מיקרוגרם / מ"ל ​​NGF. הגב עובריים קציר שורש הגרעינים (DRG) מ E-15 גורי חולדה. DRG אמור להיות מצופה על מצופה קולגן 6-מוסיף גם, כמה שיותר ארבעה לכל הכנס. דגירה מוסיף למשך 2 שעות, כדי לאפשר DRG דבקות הממברנה. ב Dynamic photopolymerization מסכה מכשיר micromirror הדיגיטלי (DMD) היא 1024 x 768 מערך של מראות בודדים, דומה לזה של טלוויזיות הקרנה, אשר משקף באופן סלקטיבי אור מבוסס על עמדה במראה. לענייננו, DMD משמש אור אולטרה סגול (UV) על גבי תבנית הידרוג photocrosslinkable, יצירת גאומטריות הידרוג specifiable בצורה פשוטה ומהירה. איור 1 מתאר את ההתקנה של נתיב האור DMD ו-UV. למרות DMD שלנו היא יחידה עצמאית, המכשיר יכול גם להיות משולבת לשימוש עם מיקרוסקופים רבים הקיימים. הסר את כל נוזל עודף להוסיף, ולהוסיף 500 μL של המדיום פילמור בתוך להכניס את. פילמור PEG בינוני מכיל 10% (1,000 מגה וואט) ו Irgacure 0.5% 2959 מומס בינוני neurobasal בתוספת 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו – NGF פן 1% / סטרפטוקוקוס. מניחים את הכנס מתחת למכשיר DMD בשקופית Rain-X כוס טיפול. טען את התמונה בשחור לבן מתאים לשמש "photomask" על DMD, באמצעות התוכנית כללה GUI ALP-3 בסיסית. לענייננו, בצורת מתפצל נבחר כדי לאפשר יישום של מערכות neurite הדרכה. באמצעות מיקרוסקופ הפוך להדמיה, ליישר את explants רקמה עם המיקום המתאים על photomask באמצעות מקור האור הנראה המשקף את DMD. החלף את מקור האור הנראה את מקור האור האולטרה סגול, ולהאיר את הפתרון PEG עד crosslinking מספיק. (לקבלת התנאים נתון 5.0 ווטס / 2 ס"מ על התקרית DMD, crosslinking ניתן להשלים קטנה כמו 55 שניות.) חזור על הפעולה עבור כל ארבעת DRG על להכניס את. לשטוף כל להכניס שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס. הוסף בינוני צמיחה 1.5mL מתחת מוסיף תרבית תאים, ומאפשרים לאזן באינקובטור במשך 30 דקות. בינוני צמיחה בינוני neurobasal המכיל 27 B-2%, פן 1% / סטרפטוקוקוס, 0.5mm-L-גלוטמין ו -20 מיקרוגרם / מ"ל ​​NGF. ג משניים הידרוג Puramatrix עבור יישומים העצבית, Puramatrix 1% היא מדוללת על פי הוראות היצרן% 0.15 ב סטרילי H 2 O שיושלם עם laminin מיקרוגרם / מ"ל 1 מסיסים. התקשורת כל עודף יש להסיר מן החללים PEG, אשר מכילים את explants DRG, בעזרת צמר גפן סטרילי קצה המוליך, Kimwipe, או micropipette. Puramatrix מתווסף חללים PEG עם micropipette על מנת למלא את החלל ללא גדותיו. בהתאם נפח חלל, בדרך כלל ~ 1 μL משמש לכל לבנות. Puramatrix מתחיל תהליך של הרכבה עצמית מיד במגע עם תמיסת מלח פיזיולוגית, כלומר PEG נפוח, אבל 1.5 מ"ל של מדיום גידול נוסף מתחת להכניס את והניח בחממה במשך שעה אחת כדי להבטיח gelation מוחלט. בתחילה, Puramatrix הוא חומצי מעט, כדי לשנות את התקשורת אחרי שעה אחת על מנת לאפשר pH כדי לאזן. שינויים מדיה נדרשים בערך כל 48 שעות. היזהר כי התקשורת היא כלנוסף מתחת להכניס את, על מנת להגן על היושרה של Puramatrix חלש מכנית. Agarose עבור יישומים העצבית, agarose הוא מדולל לפתרון 1% בטווח הבינוני הצמיחה להציב אמבט מים 60 מעלות צלזיוס עד agarose נמס לגמרי (~ 1 שעות). הפתרון הוא השלים אז עם מיקרוגרם 1 / laminin מסיסים מ"ל. התקשורת כל עודף יש להסיר מן החללים PEG. Agarose מתווסף חללים PEG על מנת למלא את החלל ללא גדותיו. תלוי בנפח של חלל, בדרך כלל ~ 1 μL משמש לכל לבנות. 1.5 מ"ל של מדיום הגידול מראש מצונן (8 ° C) בצלחת 6-היטב, ואת מוסיף agarose המכיל מועברים בתקשורת צונן ומתוחזק במקרר ב 8 מעלות צלזיוס לפחות במשך שלוש דקות כדי לאפשר agarose ג'ל. לבסוף, מוסיף את מועברים 1.5 מ"ל של מדיום מראש חימם צמיחה (37 ° C) ומתוחזק בחממה ב -37 מעלות צלזיוס, עם שינויים התקשורת נדרש כל 48 שעות. 3. Hydrogel Dual 3D תא Encapsulation אנקפסולציה הידרוג כפול מתאים בעת שימוש כלשהו ג'ל הרכבה עצמית. ג'ל photocrosslinkable, ב PEG במקרה זה, משמשת תמיכה מבנית להצגת הגיאומטרי של ג'ל הרכבה עצמית, למשל Puramatrix או agarose. חלק מהשיטות, במיוחד סוג של ג'ל ובחירת photomask, יהיה תלוי ביישום המבוקש בפרט. טען מסיכת המתאים DMD. עבור יישום קיומנו התא, אנחנו פשוט בחרו מצגת גלילי של Puramatrix לסייע הדמיה של תאים. חוקרים לומדים איתות התא עשוי להיות מעוניין הגיאומטריה compartmental כדי לאפשר דיפוזיה של מולקולות chemotactic. בנוסף, קירוב גס של עורק הוצגה לייצג את היישום ניתן מחקר כלי דם. פנקו את קירות התא להכניס תרבות פוליאסטר עם גשם-X, מקום תחת DMD בשקופית גשם X-מצופה. הוספת 500 μL של המדיום פילמור להכניס את. להשרות crosslinking PEG על ידי חשיפה לאור UV במשך 55 שניות. לשטוף שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס. הסר את כל התקשורת העולה מן החללים PEG. ספין למטה תאים בצפיפות הרצויה לתוך גלולה. יש להקפיד להסיר את כל אמצעי מן גלולה התא לפני ערבוב, כמו Puramatrix מתחיל הרכבה עצמית מיד במגע עם תמיסת מלח. להשעות את התאים בתוך Puramatrix 0.15% בדילול מלא סטרילי H 2 O בתוספת 10% סוכרוז. להזריק את Puramatrix / תא / סוכרוז התערובת בתוך חללים PEG. הוסף 1.5 מ"ל של מדיום הגידול מתחת להכניס את, ולאפשר ג'ל בתוך אינקובטור במשך שעה אחת. שינוי התקשורת לאחר שעה אחת, ו ~ כל 48 שעות לאחר מכן. 4. Hydrogel יחיד 3D תא Encapsulation אנקפסולציה הידרוג אחד יהיה מתאים לכל מצב שבו תאים ניתן לבדוק בתוך הידרוג photocrosslinkable. טען מסיכת המתאים DMD. עבור מחקרים הישרדות התא, אנחנו שוב בחרה מסכה מעגלי בסיסי כדי לייצג גליל. מסכות דומות לאלו המוצגות שיטה 4 יכול להיות מיושם שוב לשדה המחקר המתאים. התייחס תא פוליאסטר תרבות להכניס עם גשם-X, מקום תחת DMD בשקופית גשם X-מצופה. תאים בריכוז כל הרצוי ניתן להוסיף ישירות לפתרון PEG 10%, מערבבים היטב כדי להבטיח חלוקה הומוגנית. הוספת 500 μL של המדיום פילמור להכניס את. להשרות crosslinking PEG על ידי חשיפה לאור UV במשך 55 שניות. לשטוף שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס. בינוני מלא עם צמיחה הן מתחת ומעל להוסיף, לשנות כל ~ 2 ימים. 5. סרט דק Hydrogel פילמור טען מסיכת המתאים DMD. לטפל קולגן מצופה פוליאסטר תא תרבות להכניס עם ה-X גשם, ובמקום בשקופית גשם X-מצופה. הוסף בינוני פילמור מספיק כדי לכסות רק את החלק התחתון של להכניס (~ 250-300 μL עבור 6-מוסיף גם צלחת). אפשר התקשורת לחדור את הממברנה להכניס עבור 30-45 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בינוני פילמור עודף להכניס את עם micropipette או Kimwipe. הוספת כמות מספקת של נפט UV שקוף כדי לכסות לחלוטין את תחתית להכניס את. אפשר להכניס את לשבת 15-30 דקות בטמפרטורת החדר, זמן מספיק שמן כדי ליצור שכבה ברורה מעל להרוות פילמור המדיום קרום להוסיף. מניחים את הכנס והחלק תחת DMD. להשרות crosslinking PEG על ידי חשיפה לאור UV. בגלל הרזון של השכבה PEG, crosslinking ניתן להשלים קטנה כמו 15 שניות על 5.0 ואט / 2 ס"מ על התקרית DMD. <li> לשטוף את להכניס שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס. (אם ההתמדה של משקע שומני היא דאגה, חומרי ניקוי קלה כגון Tween 20 (1%) ניתן להוסיף למאגר לשטוף). חנות להוסיף צלחת 6-גם בתרבית רקמה. הוסף בינוני צמיחה לתאי מושעה, בריכוז הרצוי טפטפת נפח מספיק של ההשעיה בתוך התא להוסיף את התרבות התא כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויים. לאחר מכן, להוסיף בינוני צמיחה מספיק למטה להכניס את לחלוטין לשמור על כדאיות התא (~ 1.5 מ"ל). לאחר 48 שעות חלפו, לשטוף להכניס שלוש פעמים עם DPBS סטרילית 1% עט סטרפטוקוקוס כדי לסלק את כל התאים unadhered. שינוי התקשורת כ 48 שעות כל פעם. 6. נציג תוצאות דוגמאות הידרוג כפול המכיל בונה explants DRG מוצגות באיור 2. שימו לב כי הגירה הסלולר הרחבה neurite מוגבל לאזור תא מתירנית של הידרוג כפול לבנות. איור 3 מתאר תאים ניתק במארז דומה בתוך המבנים הידרוג כפול. בשל אופייה הדינמי של photomask DMD, הגיאומטריה זמין אנקפסולציה מוגבל רק על ידי הממדים ברזולוציה של אופטיקה. אנקפסולציה Cell היה גם אפשרי בתוך הידרוג photopolymerizable יחיד, PEG, ומבחן חי / מת הכדאיות בוצעה כפי באיור 4. Encapsulation ב PEG נועד רק כדוגמה, כמו PEG אינו מהווה סביבה אידיאלית עבור תאים עצביים. לכן, הכדאיות תא מתממש בונה PEG שלנו נמוכה. לבסוף, דוגמאות של ניצול סרטים PEG דק כשכבת כובל בדוגמת עבור הידבקות התא מוסיף על תרבית תאים מוצגים באיור 5. בנוסף, דוגמאות של התוצאות אפשרי "רע" מוצעות באיור 6. התוצאות מייצגות רק חלק קטן של השימושים האפשריים של שיטות שפותחו במעבדה שלנו. הם אמורים להדגים, קלות צדדיות ואת הכדאיות של הגישה שלנו, והוא יכול להתייחס אליהם כאל "הוכחה של עקרון" לחוקרים לפתח התאמות אפשרי שלהם. באיור 1. איור סכמטי של נתיב האור המשמש photolithography. הבלעה: אור אולטרה סגול מאיר את DMD בזווית של 45 מעלות, ו – ° 24 מתחת למטוס של המערך במראה. איור 2. הצמיחה תווית ושגשוגם של DRG המכיל בונה הידרוג כפול. לספירה) תמונות המתארות polymerized בונה PEG (אפור) עם neurites שכותרתו עם בטא טובולין III (ירוק), גרעינים DAPI תא צבעונית (כחול). Explants DRG הכלולים Puramatrix והוא ממוקם באזורים מעגלי של הדפוס, עם neurites הגוברת כלפי הסתעפות (ים). איור 3. בונה הידרוג כפול המכיל תאים שכותרתו עם calcein בבוקר, סמן תא חי, לאחר 48 שעות במדיום הגידול. לספירה) צורות PEG שונים, מלא Puramatrix המכיל ניתק נוירונים DRG (~ 5×10 3 תאים / מ"ל). איור 4. הידרוג יחיד לבנות המכיל תאים חיים שכותרתו עם Calcein AM (ירוק) ו – תאים מתים שכותרתו עם ethidium homodimer-1 (אדום) לאחר 24 שעות במדיום הגידול (5×10 3 תאים / מ"ל). איור 5. PEG Cell מגבילים polymerized כמו סרט דק באמצעות "דפוס מבחן" באופן סלקטיבי תאים לדבוק ניתק את קרום קולגן מצופה של תומך חדיר. A, B) תאים חיים מסומנים לאחר 48 שעות עם Calcein AM (ירוק), ואילו התאים המתים מסומנים עם ethidium homodimer-1 (אדום). הידבקות תא מינימלי מתרחשת באזור המכיל את הסרט PEG דק. איור 6. תמונות הנציג של תוצאות לא רצויות. א) פילמור חלקית של PEG, המוביל PEG שמיש לבנות. פילמור לא נכון יכול להתרחש בשל נוכחותם של המניסקוס במדיום מראש הפולימר, כמויות מספיקות של המדיום פילמור, חשיפה UV מספיק להתמקד או לא תקין של אופטיקה. ב) תמונה המתארת ​​polymerized בונה PEG (אפור) עם neurites שכותרתו עם בטא טובולין III (ירוק), גרעינים DAPI תא מוכתם (כחול). Neurites הצליחו לגדול מחוץ ערוצי PEG בדוגמת. זה מתרחש לעיתים קרובות במצב זה Puramatrix גולש על גבי החלק PEG במהלך ההזרקה.