Изготовление Micropatterned гидрогелей для нейронных системах культуры с использованием динамических Фотолитография Проекция маски
Summary
Простые методы описаны для быстрого производства microfabricated нервной системе культуры с помощью цифровых устройств микрозеркальным для динамической проекции литографии маску на регулярной субстратов клеточной культуры. Эти культуры системы могут быть более представительным естественных биологических архитектуры, и методы, описанные могут быть адаптированы для многочисленных приложений.
Abstract
Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting “2.5D” structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (<200 μm) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.
Protocol
Discussion
Метод, описанный здесь может быть использован любой следователь ищет простые и воспроизводимые системах клеточных культур. Теоретически, из-за широкого спектра фотополимеризующихся гидрогелей доступны, окружающей среде могут быть приспособлены, чтобы для использования с любым типом клеток, в том числе целые эксплантаты ткани. Кроме того, двойная система позволяет гидрогель для улучшения пространственного контроля в презентации собственного полимеризации гидрогелей, которые склонны к образованию аморфной формы сами по себе. В результате "2.5D" строит micropatterned гидрогеля обеспечивают 3D-матрицы для нейронных роста представлены в 2D конфигурации, которая позволяет удобно микроскопические оценки. Подложки, на которой гели полимеризуются также могут быть разнообразны, что позволяет лучше контролировать в экспериментальном дизайне. Наши методы оптимизированы для работы с культурой клеток поддерживает проницаемой, как мы видели улучшение жизнеспособности (рис. 4) по сравнению с полимеризацией на стеклах (данные не приведены). Тем не менее, другие поверхности полимеризации может быть более применимо для различных областей применения: изготовление на стеклах, используемых в экспериментах или микрофлюидики образований ячейки совокупности, например.
Наш опыт работы с этими системами культуры привело к выявлению потенциальных областей сложности. Во-первых, осторожно методы, необходимые для поддержания стерильности конструкций. Из-за громоздкого характера DMD установки, трудно работать полимеризации шаги в стерильных условиях. Для борьбы с этой проблемой, промойте шаг описан в методах полезно, и антибиотики должны использоваться во всех средствах массовой информации. Кроме того, конечная толщина и форма построить полимеризованного очень сильно зависит от жидкости поведение предварительно полимерная смесь, а также наличие мениска может привести к геля конструкции, слишком тонкие или не полностью полимеризованной (рис. 6). Два шаги могут быть предприняты, чтобы минимизировать образование мениска внутри вставки культуре клеток. Для толстых гидрогели (> 200 мкм), простое покрытие дождя-X вокруг внутренней стенки вставки достаточно. Однако, как кратко описано выше, для тонких конструкций (<200 мкм), масляный слой необходимо как минимизировать мениска и свести на нет кислорода тушения радикальной полимеризации. Резолюция была установлено, что в зависимости от толщины, с уменьшением размера элемента осуществляется с более толстыми гели. Резолюция также варьировать в зависимости от того, представлена функция положительного или отрицательного рельефа в гидрогеля. Тем не менее, мы достигли достаточного разрешения для конструкции с минимальными размерами функция в масштабе ~ 100 мкм, используя только цели микроскопом, как фокусирующей оптикой.
Наши эксперименты показали, что двойной конструкции гидрогеля, описанные здесь, представляют собой прекрасную основу для формирования основных в лабораторных моделях роста аксонов и руководство. Micropatterning используемой техники является адаптация существующих методов 18,19, но наши настройки подчеркнул, прост в реализации дизайна и была оптимизирована для производства двойной конструкции гидрогеля на вставками культуре клеток; вставками культуре клеток жизненно важное значение для повышения жизнеспособности клеток, а также в качестве сшивающего вокруг ранее приверженцем эксплантатов ткани. Сфера результаты, показанные ограничивается интересами нашей лаборатории, однако мы считаем, что методы, описанные в данной публикации, окажутся полезными для исследователей поисках относительно дешевой, быстрой и простой в использовании метод для изготовления 3D культуре клеток моделей.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить лабораторию профессора Энтони Windebank для обмена опытом по DRG рассечение и культуры, а также профессор Чен Shaochen за полезные обсуждения, касающиеся DMD установки. Это исследование было профинансировано частично Тьюлейн университета и грантов от штата Луизиана Совет регентов (LEQSF [2009-10]-RD–18) и NIH (NS065374).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Digital Micromirror Device | Texas Instruments | DLPD4X00KIT | ||
| Collagen Coated Transwell Permeable Support | Corning | 3491 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
| Polyester Transwell Permable Support | Corning | 3412 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-036 | ||
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-164 | ||
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | ||
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
| DPBS | Invitrogen | 14190-250 | ||
| Puramatrix | BD Biosciences | 354250 | ||
| PEG 1000 | Polysciences, Inc. | 15178 | ||
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | 0298913AB | ||
| Oil | Have used both canola oil and silicon oil | Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation | ||
| OmniCure Series 1000 | Exfo | |||
| Rain-X |
References
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).
- Schindler, M. Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine. Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).
- Maltman, D. J., Przyborski, S. A. Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses. Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn’t flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).
- Irons, H. R. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).
- Bursac, N. Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties. Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Cushing, M. C., Anseth, K. S. Materials science. Hydrogel cell cultures. Science. 316, 1133-1134 (2007).
- Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324, 59-63 (2009).
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).
- Luo, Y., Shoichet, M. S. A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration. Nature Materials. 3, 249-253 (2004).
- Wylie, R. G., Shoichet, M. S. Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel. Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).
- Ji, Y. Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds. Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).
- Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
- Xu, T. Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method. Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).
- Liu Tsang, V. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, 790-801 (2007).
- Beebe, D. J. Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).
- Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).
- Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays. Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).
