Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

1. DMD Setup De DMD raad van bestuur, UV-licht gids (met collimator) en 4x objectief zijn allemaal verticaal gemonteerd op een trillingsisolerende tafel. Het UV-licht gids moet zodanig worden ingesteld dat het licht de spiegel reeks hits op een hoek van 45 ° ten opzichte van het vlak van de spiegels, en 24 ° onder het vlak van de spiegels (figuur 1). Het objectief is gemonteerd, zodat de afstand van de DMD aan de doelstelling lens komt overeen met de brandpuntsafstand in verband met de lens. Een omgekeerde microscoop bevindt zich onder het objectief, zodanig dat het gericht licht wordt weerkaatst door de DMD kan worden gevisualiseerd door de microscoop. De afstand van de doelstelling lens om de polymerisatie oppervlakte moet ongeveer overeenkomen met de werkafstand van de lens. Het podium op de microscoop kan dan gebruikt worden om deze afstand aan te passen aan fijn scherp op het beeld. Deze afstand kan variëren afhankelijk van de gekozen polymerisatie oppervlak. 2. Dual Hydrogel Constructen voor Tissue explantatie Culturen A. DRG explantatie hechting Smeer de wanden van de 6-well collageen gecoate celkweek inserts (Corning) met Rain-X, en zorg ervoor dat het membraan zelf te voorkomen. (Als alternatief kan een hydrofobe barrière pen worden gebruikt.) Hydrate inserts 's nachts met 1,5 ml van de hechting medium in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. Adhesie medium is neurobasal medium met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 0,5 mm L-glutamine, en 20 ug / ml NGF. Oogst embryonale achterwortelganglia (DRG) van de E-15 ratten pups. DRG moet worden uitgeplaat op collageen gecoate 6-well inserts, maar liefst vier per voegen. Incubeer inserts voor 2 uur, zodat voor de DRG de naleving van het membraan. B. Dynamische masker fotopolymerisatie Een digitaal Micromirror apparaat (DMD) is een 1024 x 768 reeks van individuele spiegels, vergelijkbaar met die in de projectie televisies, die selectief licht reflecteert op basis van spiegel positie. Voor ons doel is de DMD gebruikt voor het patroon ultraviolet (UV) licht op fotoverknoopbare hydrogels, het creëren van bepaalbare hydrogel geometrieën in een eenvoudige en snelle manier. Figuur 1 toont de inrichting van het DMD-en UV-licht pad. Hoewel onze DMD is een zelfstandige eenheid, kan het apparaat ook worden geïntegreerd voor gebruik met veel bestaande microscopen. Verwijder alle overtollige vloeistof uit te voegen, en voeg 500 ul van polymerisatie medium binnen het in te voegen. Polymerisatie medium bevat 10% PEG (MW 1000) en 0,5% Irgacure 2959 opgelost in neurobasal medium aangevuld met 20 ug / ml NGF en 1% Pen / Strep. Leg het element onder het DMD apparaat op een Rain-X behandeld glasplaatje. Laad het juiste zwart-wit beeld om te worden gebruikt als een "fotomasker" op de DMD, door het gebruik van de meegeleverde ALP-3 basic GUI-programma. Voor onze doeleinden, is een bifurcating vorm gekozen om voor de uitvoering van neurieten geleidingssystemen. Met behulp van een omgekeerde microscoop voor visualisatie, lijnt het weefsel explantaten met de juiste locatie op de fotomasker met behulp van een zichtbare lichtbron weerkaatst de DMD. Schakel het zichtbare licht bron voor de UV-lichtbron, en verlichten van de PEG-oplossing totdat verknoping is voldoende. (Voor de voorwaarden gegeven en 5,0 Watt / cm 2 incident op de DMD, verknoping kan worden voltooid in slechts 55 seconden.) Herhaal dit voor alle vier de DRG op de insert. Was elke insert drie keer met steriele DPBS en 1% Pen-Strep. Voeg 1,5 ml groeimedium onder de celkweek inserts, en laat in een incubator equilibreren gedurende 30 minuten. Groeimedium is neurobasal medium dat 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0,5 mm L-glutamine, en 20 ug / ml NGF. C. Secundaire hydrogel Puramatrix Voor de neuronale toepassingen, is 1% Puramatrix verdund volgens de instructies van de fabrikant tot 0,15% in een steriele H 2 O en aangevuld met 1 ug / ml oplosbaar laminine. Alle overtollige media moeten worden verwijderd uit de PEG vides, die de DRG explantaten bevatten, met behulp van een steriel wattenstaafje applicator, Kimwipe of micropipet. Puramatrix wordt toegevoegd aan de PEG vides met een micropipet om de lege ruimte op te vullen, kan uitzetten. Afhankelijk van het dode volume, meestal ~ 1 ui wordt gebruikt per bouwen. Puramatrix begint onmiddellijk het proces van zelf-assemblage na contact met een fysiologische zoutoplossing, dat wil zeggen de gezwollen PEG, maar 1,5 ml groeimedium toegevoegd onder de insert en geplaatst in de incubator gedurende een uur aan de totale gelering te verzekeren. In eerste instantie Puramatrix is ​​licht zuur, zodat veranderingen in de media na een uur om de pH van het evenwicht. Media veranderingen nodig ongeveer elke 48 uur. Wees voorzichtig dat alle media istoegevoegd onder de insert, om de integriteit van mechanisch zwakke Puramatrix te beschermen. Agarose Voor de neuronale toepassingen wordt agarose verdund tot een 1% oplossing in groeimedium en geplaatst in een 60 ° C waterbad tot de agarose volledig oplost (~ 1 uur). De oplossing wordt dan aangevuld met 1 ug / ml oplosbaar laminine. Alle overtollige media moeten worden verwijderd uit de PEG vides. Agarose wordt toegevoegd aan de PEG holtes in om de lege ruimte op te vullen, kan uitzetten. Afhankelijk van het volume van de leegte, meestal ~ 1 ui wordt gebruikt per bouwen. 1,5 ml groeimedium is vooraf gekoeld (8 ° C) in een 6-wells plaat, en de agarose met inserts worden overgebracht naar de gekoelde media en onderhouden in een koelkast bij 8 ° C gedurende ten minste drie minuten agarose laten gel. Ten slotte worden de inserts overgebracht naar 1,5 ml voorverwarmde groeimedium (37 ° C) en gehandhaafd in de incubator bij 37 ° C, met de media veranderingen nodig zijn om de 48 uur. 3. Dual Hydrogel 3D Cell Encapsulation Dual hydrogel inkapseling is geschikt wanneer het gebruik van een zelf-assemblage gel. De fotoverknoopbare gel, in dit geval PEG, fungeert als een structurele ondersteuning voor de geometrische presentatie van de zelf-assemblage gel, bijvoorbeeld Puramatrix of agarose. Sommige van de methoden, met name de aard van de gel en de keuze van fotomasker, zal afhangen van de specifieke gewenste toepassing. Laad een geschikt masker op de DMD. Voor onze toepassing, overleving van de cel, we simpelweg gekozen voor een cilindrische presentatie van Puramatrix om te helpen bij de beeldvorming van cellen. Onderzoekers bestuderen van cell signaling geïnteresseerd zou zijn in een compartimentele geometrie te zorgen voor de verspreiding van chemotactische moleculen. Daarnaast werd een ruwe benadering van een slagader aangetoond dat het mogelijke toepassing te vertegenwoordigen bloedvat onderzoek. Behandel de wanden van een polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats onder DMD op Rain-X gecoate glijbaan. Voeg 500 ul van polymerisatie medium om het in te voegen. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht voor 55 seconden. Was driemaal uit met steriel DPBS en 1% Pen-Strep. Verwijder al het overtollige papier uit de PEG vides. Spin down-cellen op de gewenste dichtheid in een pellet. Zorg moet worden genomen om alle medium te verwijderen uit de celpellet voorafgaand aan de mixen, zoals Puramatrix begint self-assembly onmiddellijk na contact met een zoutoplossing. Hang de cellen binnen 0,15% Puramatrix verdund in een steriele H 2 O aangevuld met 10% sucrose. Injecteer de Puramatrix / cel / sucrose mengsel in holtes in de PEG. Voeg 1,5 mL van de groei medium onder de insert, en laat de gel in incubator gedurende een uur. Verandering media na een uur, en ~ om de 48 uur daarna. 4. Single Hydrogel 3D Cell Encapsulation Een hydrogel inkapseling geschikt zou zijn voor iedere situatie waarin de cellen binnen kan worden onderzocht van een fotoverknoopbare hydrogel. Laad een geschikt masker op de DMD. Voor de overleving van de cel studies hebben we opnieuw gekozen voor een basic cirkelvormig masker om een ​​cilinder te vertegenwoordigen. Maskers vergelijkbaar met die getoond in de methode 4 weer kon worden toegepast voor het juiste gebied van onderzoek. Behandel een polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats onder DMD op Rain-X gecoate glijbaan. Cellen op elke gewenste concentratie kan direct worden toegevoegd aan de 10% PEG-oplossing, mengen goed om een ​​homogene verdeling te garanderen. Voeg 500 ul van polymerisatie medium om het in te voegen. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht voor 55 seconden. Was driemaal uit met steriel DPBS en 1% Pen-Strep. Vul met groeimedium zowel onder als op de top van de insert, veranderende elke ~ 2 dagen. 5. Thin Film Hydrogel Polymerisatie Laad een geschikt masker op de DMD. Behandel een collageen gecoat polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats op Rain-X gecoate glijbaan. Voeg voldoende polymerisatie medium tot net onder de bodem van de insert (~ 250-300 ul voor 6-wells plaat inserts). Laat de media om de insert membraan doordringen gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder overtollige polymerisatie medium van de insert met een micropipet of Kimwipe. Voeg een voldoende hoeveelheid UV-transparante olie volledig te bedekken de bodem van de insert. Laat de insert om voor 15-30 minuten zitten bij kamertemperatuur, lang genoeg voor de olie tot een aparte laag boven de polymerisatie medium het verzadigen van de insert membraan te vormen. Plaats het inzetstuk en schuif onder de DMD. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht. Vanwege de geringe dikte van de PEG laag, kan verknopen worden afgerond in slechts 15 seconden bij 5,0 Watt / cm 2 incident op de DMD. <li> Was de insert drie keer met steriele DPBS en 1% Pen-Strep. (Als het voortbestaan ​​van een olieachtig residu is een punt van zorg, kan een mild schoonmaakmiddel, zoals Tween 20 (1%) worden toegevoegd aan de wasbuffer.) Bewaar de insert in een 6-well weefselkweek plaat. Voeg groeimedium aan gesuspendeerd cellen, in de gewenste concentratie, en pipet een voldoende volume van de celsuspensie in de cel cultuur te plaatsen om de gewenste cel dichtheid te verkrijgen. Vervolgens voeg genoeg groeimedium onder de insert volledig behouden levensvatbaarheid van de cellen (~ 1,5 ml). Na 48 uur zijn verstreken, was de inzet drie keer met steriele DPBS en 1% Pen-Strep aan een unadhered cellen los te maken. Verandering media ongeveer een keer per 48 uur. 6. Representatieve resultaten Voorbeelden van dubbele hydrogel constructen die DRG explantaten zijn weergegeven in figuur 2. Merk op dat cellulaire migratie en neurieten uitbreiding is beperkt tot de cel tolerante streek van de dubbele hydrogel bouwen. Figuur 3 toont gescheiden cellen op dezelfde ingekapseld in de dubbele hydrogel constructen. Vanwege het dynamische karakter van het DMD fotomasker, is de geometrie beschikbaar is voor inkapseling alleen beperkt door de afmetingen en resolutie van de optiek. Cel inkapseling was het ook mogelijk in een enkel fotopolymeriseerbare hydrogel, PEG, en een live / dode levensvatbaarheid test werd uitgevoerd, zoals blijkt in figuur 4. Inkapseling in PEG is alleen bedoeld als een voorbeeld, evenals PEG niet een ideale omgeving voor neurale cellen vertegenwoordigen. Daarom is de levensvatbaarheid van de cellen gerealiseerd in onze PEG construeert is begrijpelijk laag. Tot slot, zijn voorbeelden van het gebruik van dunne films PEG als een gedessineerde beperkend laag voor cel-adhesie op celkweek inserts weergegeven in figuur 5. Daarnaast zijn voorbeelden van mogelijke "slechte" resultaten aangeboden in Figuur 6. De resultaten vormen slechts een klein deel van de mogelijke toepassingen van de ontwikkelde methoden in ons lab. Ze zijn bedoeld om het gemak, veelzijdigheid en de levensvatbaarheid van onze aanpak aan te tonen, en kan worden behandeld als 'proof of principle "voor onderzoekers om hun eigen mogelijke aanpassingen te ontwikkelen. Figuur 1. Schematische weergave van het lichtpad wordt gebruikt voor fotolithografie. Inzet: De UV-licht verlicht de DMD onder een hoek van 45 ° en 24 ° onder het vlak van de spiegel array. Figuur 2. Gelabelde de groei en proliferatie in DRG met dual hydrogel constructen. AD) Afbeeldingen portretteren gepolymeriseerde PEG constructen (grijs) met neurieten gemerkt met Beta III tubuline (groen), DAPI gekleurde celkernen (blauw). De DRG explantaten zijn opgenomen in Puramatrix en gelegen in de circulaire regio's van de patroon, met neurieten groeien naar de splitsing (s). Figuur 3. Dual hydrogel constructen die cellen gelabeld met calceïne AM, een levende cel marker, na 48 uur in groeimedium. AD) Verschillende PEG vormen, gevuld met Puramatrix met gedissocieerde DRG neuronen (~ 5×10 3 cellen / ml). Figuur 4. Single hydrogel construct bevattende levende cellen gemerkt met Calceïne AM (groen) en dode cellen gelabeld met ethidium homodimeer-1 (rood) na 24 uur in groeimedium (5×10 3 cellen / ml). Figuur 5. Cell beperkende PEG gepolymeriseerd als een dunne film met behulp van een "test patroon" selectief gedissocieerde cellen zich aan het collageen gecoate membraan van doorlatend ondersteunt. A, B) Levende cellen zijn gelabeld na 48 uur met Calceïne AM (groen), terwijl de dode cellen zijn voorzien van ethidium homodimeer-1 (rood). Minimale celadhesie vindt plaats in het gebied met de dunne PEG film. Figuur 6. Vertegenwoordiger beelden van ongewenste resultaten. A) Gedeeltelijke polymerisatie van PEG, wat leidt tot een onbruikbaar PEG te bouwen. Onjuiste polymerisatie kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van een meniscus in de pre-polymeer medium, onvoldoende hoeveelheden van de polymerisatie medium, onvoldoende UV-blootstelling of oneigenlijk focus van de optiek plaatsvinden. B) Image portretteren gepolymeriseerde PEG constructen (grijs) met neurieten gemerkt met Beta III tubuline (groen), DAPI gekleurde celkernen (blauw). De neurieten waren in staat om te groeien buiten het patroon PEG-kanalen. Dit gebeurt vaak in de voorwaarde dat Puramatrix overflows op de top van de PEG deel tijdens de injectie.