Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

1. DMD installazione La scheda DMD, guida di luce UV (con collimatore) e la lente obiettivo 4x sono tutti montati verticalmente su un tavolo isolamento dalle vibrazioni. La guida ai raggi UV deve essere regolata in modo che la luce colpisce l'array specchio con un angolo di 45 ° rispetto al piano degli specchi, e 24 ° sotto il piano degli specchi (Figura 1). La lente obiettivo è montato in modo che la distanza dalla DMD alla lente obiettivo corrisponde alla lunghezza focale associata con la lente. Un microscopio invertito è posto sotto la lente dell'obiettivo, in modo che la luce focalizzata riflessa dalla DMD possono essere visualizzati attraverso il microscopio. La distanza dalla lente obiettivo alla superficie polimerizzazione dovrebbe corrispondere a circa la distanza di lavoro della lente. Il palco sul microscopio può quindi essere usato per regolare questa distanza a fuoco con precisione l'immagine. Questa distanza può variare a seconda della superficie polimerizzazione scelto. 2. Costruisce Hydrogel doppio per Tissue Culture Espianto A. DRG espianto adesione Rivestire le pareti di 6-cell e inserti rivestiti cultura collagene (Corning) con Rain-X, avendo cura di evitare la membrana stessa. (In alternativa, una penna barriera idrofoba può essere utilizzato.) Inserti idrato durante la notte con 1,5 ml di adesione medio in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. L'adesione media è di media neurobasal con il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina, 0.5mm L-glutamina, e 20 mg / ml di NGF. Harvest embrionale radice gangli dorsali (DRG) da E-15 cuccioli di ratto. DRG dovrebbe essere placcato sul collagene rivestito da 6 e inserti, ben quattro per inserto. Incubare inserti per 2 ore per consentire DRG adesione alla membrana. B. Dinamica maschera fotopolimerizzazione Un dispositivo micromirror digitale (DMD) è una x 1024 768 serie di singoli specchi, simile a quella di televisori a proiezione, che riflette la luce selettivamente in base alla posizione dello specchio. Per i nostri scopi, il DMD viene usato per modello ultravioletti (UV) su idrogel photocrosslinkable, creando geometrie idrogel determinabile in modo semplice e rapido. La figura 1 mostra la configurazione del percorso DMD e raggi UV. Anche se il nostro DMD è una unità autonoma, il dispositivo può essere integrato anche per l'uso con molti microscopi esistenti. Rimuovere tutto il liquido in eccesso da inserire ed aggiungere 500 ml di polimerizzazione medio dentro l'inserto. Medio di polimerizzazione contiene il 10% PEG (MW 1000) e 0,5% Irgacure 2959 sciolto in media neurobasal integrata con 20 mg / ml di NGF e 1% Pen / Strep. Collocare l'inserto sotto il dispositivo DMD su un Rain-X vetrino trattati. Caricare l'immagine appropriata in bianco e nero da utilizzare come "fotomaschera" sul DMD, attraverso l'uso del programma incluso ALP-3 GUI di base. Per i nostri scopi, una forma biforcano è stato scelto per consentire l'attuazione di sistemi di guida dei neuriti. Utilizzando un microscopio invertito per la visualizzazione, allineare il espianti di tessuto con la posizione appropriata sul fotomaschera utilizzando una sorgente di luce visibile riflessa della DMD. Accendere la sorgente di luce visibile per la sorgente di luce UV, e illuminare la soluzione di PEG fino a reticolazione è sufficiente. (Per le condizioni date e 5,0 watt / cm 2 incidente sul DMD, reticolazione può essere completato in appena 55 secondi.) Ripetere per tutti i DRG quattro sull'inserto. Lavare ogni inserto tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep. Aggiungere 1,5 ml di crescita medio sotto gli inserti di coltura cellulare, e permette di equilibrare in un incubatore per 30 minuti. Mezzo di crescita e 'di medie neurobasal contenente 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0.5mm L-glutamina, e 20 mg / ml di NGF. C. idrogel secondaria Puramatrix Per le applicazioni neuronale, 1% Puramatrix viene diluita secondo le istruzioni del produttore al 0,15% in sterili H 2 O e integrata con 1 mg / mL laminina solubile. Tutti i supporti in eccesso deve essere rimosso dal PEG vuoti, che contengono le espianti DRG, utilizzando un cotton-fioc sterile, Kimwipe, o micropipetta. Puramatrix viene aggiunto alla vuoti PEG con una micropipetta per riempire lo spazio vuoto senza traboccare. A seconda del volume vuoto, tipicamente ~ 1 ml viene usato per costruire. Puramatrix inizia il processo di auto-assemblaggio immediatamente a contatto con una soluzione salina fisiologica, cioè il PEG gonfio, ma 1,5 mL di terreno di coltura viene aggiunto sotto l'inserto e messo in incubatrice per un'ora per garantire la gelificazione totale. Inizialmente, Puramatrix è leggermente acido, in modo da cambiare il supporto dopo un'ora per permettere di equilibrare il pH. Cambiamenti media sono necessari circa ogni 48 ore. Fare attenzione che tutti i media èaggiunto sotto l'inserto, per proteggere l'integrità del Puramatrix meccanicamente deboli. Agarosio Per le applicazioni neuronale, agarosio viene diluita ad una soluzione 1% a mezzo di crescita e posto in un bagno d'acqua a 60 ° C fino a quando l'agarosio si scioglie completamente (~ 1 ora). La soluzione è quindi integrata con 1 mg / mL laminina solubile. Tutti i supporti in eccesso deve essere rimosso dalla vuoti PEG. Agarosio viene aggiunto alla vuoti PEG al fine di riempire lo spazio vuoto senza traboccare. A seconda del volume di vuoto, di solito ~ 1 ml viene usato per costruire. 1,5 mL di terreno di coltura è pre-fresco (8 ° C) in un 6-pozzetti, e gli inserti di agarosio contenente vengono trasferiti ai media refrigerati e mantenuti in frigorifero a 8 ° C per almeno tre minuti per consentire di agarosio gel. Infine, gli inserti sono trasferiti a 1,5 ml di pre-riscaldato terreno di coltura (37 ° C) e mantenuto in incubatrice a 37 ° C, con cambiamenti supporto richiesto ogni 48 ore. 3. Cellulare dual incapsulamento Hydrogel 3D Incapsulamento idrogel Dual è appropriata quando si utilizza qualsiasi auto-assemblaggio gel. Il gel photocrosslinkable, in questo caso PEG, funge da supporto strutturale per la presentazione geometrica della auto-assemblaggio gel, ad esempio Puramatrix o agarosio. Alcuni dei metodi, in particolare il tipo di gel e la scelta di fotomaschera, dipenderà dalla particolare applicazione desiderata. Caricare una maschera appropriata sul DMD. Per la nostra applicazione, la sopravvivenza cellulare, abbiamo semplicemente scelto una presentazione cilindrica di Puramatrix per aiutare nella stampa delle cellule. Ricercatori che studiano segnalazione cellulare potrebbe essere interessato a una geometria compartimentale per consentire la diffusione di molecole chemiotattici. Inoltre, una rozza approssimazione di un'arteria ha dimostrato di rappresentare possibile applicazione alla ricerca dei vasi sanguigni. Trattare le pareti di un inserto in colture cellulari in poliestere con Rain-X, e di luogo in DMD su Rain-X scivolo rivestito. Aggiungere 500 l di media polimerizzazione per l'inserto. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV per 55 secondi. Lavare tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep. Rimuovere tutti i supporti in eccesso dal PEG vuoti. Spin le cellule alla densità desiderata in un pellet. Bisogna fare attenzione a rimuovere tutti i media dal pellet cellula prima della miscelazione, come Puramatrix inizia auto-assemblaggio immediatamente a contatto con una soluzione salina. Sospendere le cellule all'interno dello 0,15% Puramatrix diluita in H 2 O sterile supplementato con 10% di saccarosio. Iniettare il Puramatrix / cellula / saccarosio miscela all'interno vuoti nel PEG. Aggiungere 1,5 mL di terreno di crescita sotto l'inserto, e permettono di gel all'interno dell'incubatore per un'ora. Cambiare i media dopo un'ora, e ~ ogni 48 ore successive. 4. Singola cella incapsulamento Hydrogel 3D Un incapsulamento idrogel unico potrebbe essere appropriato per ogni situazione in cui le cellule possono essere esaminate all'interno di un idrogel photocrosslinkable. Caricare una maschera appropriata sul DMD. Per gli studi di sopravvivenza cellulare, abbiamo scelto ancora una volta una maschera di base circolare, per rappresentare un cilindro. Maschere simili a quelli mostrati nel metodo 4 potrebbe nuovamente essere applicata per il campo di ricerca appropriato. Trattare una cella inserire poliestere cultura con Rain-X, e di luogo in DMD su Rain-X scivolo rivestito. Celle in qualsiasi concentrazione desiderata possono essere aggiunti direttamente alla soluzione di PEG al 10%, mescolando bene per assicurare una distribuzione omogenea. Aggiungere 500 l di media polimerizzazione per l'inserto. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV per 55 secondi. Lavare tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep. Riempire con mezzo di crescita sia sotto che sopra l'inserto, cambiando ogni ~ 2 giorni. 5. A film sottile di polimerizzazione Hydrogel Caricare una maschera appropriata sul DMD. Trattare un collagene rivestito cellule inserire poliestere cultura con Rain-X, e il luogo di pioggia-X scivolo rivestito. Aggiungi medio di polimerizzazione sufficiente per coprire solo la parte inferiore dell'inserto (~ 250-300 microlitri per 6-e inserti di lamiera). Consentire ai media di permeare la membrana inserto per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'eccesso di polimerizzazione medio dal inserto con una micropipetta o Kimwipe. Aggiungere una quantità sufficiente di raggi UV-trasparente di olio per coprire completamente il fondo dell'inserto. Lasciare l'inserto a sedere per 15-30 minuti a temperatura ambiente, il tempo necessario per l'olio per formare uno strato distinto al di sopra della media saturando polimerizzazione della membrana inserimento. Collocare l'inserto e far scorrere sotto la DMD. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV. A causa della sottigliezza dello strato di PEG, reticolazione può essere completato in appena 15 secondi a 5,0 watt / cm 2 incidente sulla DMD. <li> Lavare l'inserto tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep. (Se la persistenza di un residuo oleoso è una preoccupazione, un detergente delicato come il Tween 20 (1%) può essere aggiunta al tampone di lavaggio.) Conservare l'inserto in un 6-pozzetti di coltura tissutale. Aggiungi terreno di coltura per cellule in sospensione, nella concentrazione desiderata e pipetta un volume sufficiente di sospensione cellulare dentro l'inserto di coltura cellulare per ottenere la densità cellulare desiderato. Quindi, aggiungere la crescita media abbastanza sotto l'inserto per mantenere completamente la vitalità cellulare (~ 1,5 ml). Dopo 48 ore sono trascorse, lavare l'inserto tre volte con DPBS sterile e l'1% Pen-Strep per rimuovere tutte le cellule unadhered. Modificare i media circa una volta ogni 48 ore. 6. Rappresentante Risultati Esempi di idrogel dual costruisce contenenti espianti DRG sono mostrati nella Figura 2. Si noti che la migrazione cellulare e l'estensione dei neuriti è limitata alla regione cellula permissiva del idrogel doppio costrutto. La Figura 3 mostra le cellule incapsulate dissociato allo stesso modo all'interno del costruisce idrogel duale. A causa della natura dinamica del fotomaschera DMD, la geometria a disposizione per l'incapsulamento è limitata solo dalle dimensioni e la risoluzione delle ottiche. Incapsulamento delle cellule è stato possibile anche all'interno di un idrogel singolo photopolymerizable, PEG, e un vivo / morto test di vitalità è stato effettuato, come evidenziato in Figura 4. Incapsulamento di PEG è inteso solo come esempio, come PEG non rappresenta un ambiente ideale per le cellule neurali. Pertanto, la vitalità cellulare realizzato nel nostro costruisce PEG è comprensibilmente bassa. Infine, esempi di utilizzo PEG film sottile come uno strato di fantasia restrittive per l'adesione cellulare su inserti colture cellulari sono mostrati in figura 5. Inoltre, esempi di possibili "cattivi" i risultati sono offerti in Figura 6. I risultati rappresentano solo una piccola frazione dei possibili usi dei metodi sviluppati nel nostro laboratorio. Essi hanno lo scopo di dimostrare l', versatilità e facilità la vitalità del nostro approccio, e potrebbero essere trattati come "prova di principio" per i ricercatori a sviluppare i loro propri adattamenti possibili. Figura 1. Illustrazione schematica del percorso della luce utilizzata per fotolitografia. Riquadro: La luce UV illumina il DMD con un angolo di 45 ° e 24 ° sotto il piano del vettore specchio. Figura 2. Crescita e la proliferazione in etichetta DRG contenenti costrutti di idrogel duale. DC) raffigurante immagini polimerizzato costruisce PEG (grigio) con neuriti marcato con beta tubulina III (verde), i nuclei delle cellule DAPI colorati (blu). Il espianti DRG sono contenuti in Puramatrix e situati nelle regioni circolare del modello, con neuriti crescente verso la biforcazione (s). Figura 3. Costruisce idrogel doppio contenente cellule marcate con calceina AM, un marker di cellule in vivo, dopo 48 ore in mezzo di crescita. DC) PEG forme diverse, piene di Puramatrix contenenti dissociata neuroni DRG (~ 5×10 3 celle / mL). Figura 4. Idrogel singola costruzione contenenti cellule vive etichettati con calceina AM (verde) e le cellule morte etichettati con etidio omodimero-1 (rossa) dopo 24 ore in mezzo di crescita (5×10 3 celle / mL). Cella Figura 5. PEG restrittive polimerizzate come un film sottile utilizzando un "modello di prova" per aderire selettivamente le cellule dissociate alla membrana rivestita di collagene di supporti permeabili. A, B) le cellule vive sono etichettati dopo 48 ore con calceina AM (verde), mentre le cellule morte vengono etichettati con etidio omodimero-1 (rossa). Adesione cellulare minima si verifica nella zona contenente il film sottile PEG. Figura 6. Immagini rappresentative dei risultati indesiderati. A) polimerizzazione parziale della PEG, portando ad una PEG inutilizzabile costruire. Polimerizzazione improprio può verificarsi a causa della presenza di un menisco nel pre-polimero medio, quantità insufficienti di media polimerizzazione, esposizione ai raggi UV insufficiente o non corretta messa a fuoco delle ottiche. B) immagine raffigurante polimerizzato costruisce PEG (grigio) con neuriti marcato con beta tubulina III (verde), i nuclei delle cellule DAPI colorati (blu). I neuriti sono stati in grado di crescere al di fuori dei canali PEG fantasia. Ciò si verifica spesso nella condizione che trabocca Puramatrix sulla parte superiore della porzione PEG durante l'iniezione.