Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

1. DMD Kurulum DMD kurulu, UV ışık kılavuzu (kolimatör) ve 4x objektif lens titreşim izolasyonu masaya dikey olarak monte edilir. UV ışık kılavuzu ışık 45 ° aynalar, 24 ° aynalar düzleminin altında (Şekil 1) düzlemine göre açıyla ayna dizisi vurur şekilde ayarlanmış olmalıdır. DMD uzaklık objektif lens odak uzaklığı lens ile ilgili karşılık gelir, böylece objektif lens monte edilir. Objektif lens, mikroskop aracılığıyla odaklanmış ışık DMD yansıyan görülebilmesi gibi ters bir mikroskop altında yerleştirilir. Polimerizasyon yüzey objektif lens arasındaki mesafe yaklaşık olarak objektif çalışma mesafesi uygun olmalıdır. Mikroskop aşamasında sonra ince Görüntüye odaklanmak için bu mesafeyi ayarlamak için kullanılabilir. Bu mesafe, seçilen polimerizasyon yüzeye bağlı olarak değişebilir. 2. Doku Eksplant Kültürler Çift Hidrojel oluşturur A. DRG eksplant yapışma Kat membran kendisi özen Yağmur-X ile 6-kuyu kollajen kaplı hücre kültürü ekler (Corning), duvarları. (Alternatif olarak, hidrofobik bir bariyer kalem olabilir.) 37 ° C ve% 5 CO 2 'de bir kuluçka yapışma orta 1.5 mL gecede Hidrat ekler. Yapışma orta,% 10 fetal sığır serumu,% 1 Penisilin / streptomisin, 0.5mm L-glutamin ve 20 mcg / ml NGF neurobasal orta. E-15 sıçan yavrular hasat embriyonik dorsal kök gangliyon (DRG). DRG dörde kadar eklemek için, kollajen kaplı 6-iyi ekler üzerine kaplanmış olmalıdır. Membran bağlılık DRG izin vermek için, 2 saat süreyle ekler inkübe edin. B. Dinamik maske fotopolimerizasyon Dijital micromirror cihazı (DMD), seçici ayna pozisyonu dayalı ışığı yansıtan projeksiyon televizyonlarda buna benzer bireysel aynalar, 1024 x 768 dizi. Bizim amaçlarımız için, DMD Belirtilebilen hidrojel geometrileri basit ve hızlı bir şekilde oluşturarak, photocrosslinkable hidrojeller üzerine desen ultraviyole (UV) ışık kullanılır. Şekil 1 DMD ve UV ışık yolu kurulumu anlatıyor. DMD bağımsız bir birim olmasına rağmen, cihaz aynı zamanda birçok mevcut mikroskopları ile kullanım için entegre edilebilir. Tüm aşırı sıvı eklemek çıkarın ve polimerizasyon orta eklemek içinde 500 mcL ekleyin. Polimerizasyon orta,% 10 PEG (MW 1000) ve 0.5% Irgacure 2959 20 mcg / ml NGF ve% 1 Kalem / Strep ile desteklenmiş neurobasal ortamda çözünmüş içerir. Yağmur-X işlenmiş cam slayt DMD cihaz altındaki ekleme yerleştirin. ALP-3 temel GUI programı kullanmak suretiyle, DMD "photomask" olarak kullanılmak üzere uygun siyah-beyaz görüntü yükleyin. Bizim amaçlarımız için, çatallanan şekli neurite rehberlik sistemlerinin uygulanması için izin seçildi. Ters bir görünüm için mikroskop kullanarak, photomask DMD yansıtan bir görünür ışık kaynağı kullanılarak uygun bir konuma sahip doku eksplantlar hizalayın. UV ışık kaynağı görünür ışık kaynağı Switch ve crosslinking yeterli kadar PEG çözüm aydınlatmak. (Koşulları için verilen ve 5.0 Watt / cm 2 olayın DMD, crosslinking az 55 saniye içinde tamamlanabilir.) Eklemek dört DRG için tekrarlayın. Her ekleme, steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. 1.5mL besi hücre kültürü ekler altına ekleyin ve 30 dakika için bir kuluçka gelmesini sağlayınız. Büyüme orta,% 2 B-27,% 1 Kalem / Strep, 0.5mm L-glutamin ve 20 mikrogram / ml NGF içeren neurobasal orta. C. Sekonder hidrojel Puramatrix Nöronal uygulamaları için,% 1 Puramatrix steril H 2 O% 0.15 üreticinin talimatlarına göre seyreltilir ve 1 mcg / mL çözünen laminin ile desteklenebilir. Tüm fazla medya, steril bir pamuk uçlu aplikatör, Kimwipe ya da mikropipet kullanarak, DRG eksplantlar içeren PEG boşlukları, kaldırılması gerekir. Puramatrix mikropipet ile PEG boşlukları dışına taşırmadan boş alanı doldurmak amacıyla eklenir. Boşluk hacmi bağlı olarak genellikle 1 mcL inşa başına kullanılan ~. Puramatrix fizyolojik tuz çözeltisi ile temas halinde hemen kendini montaj işlemi başlar, yani şişmiş PEG, ancak 1.5 mL besi toplam jelleşme sağlamak için ekleme altına eklenir ve bir saat süreyle inkübatör yerleştirilir. Başlangıçta, Puramatrix hafif asidik pH denge izin bir saat sonra ortamı değiştirmek. Medya değişiklikler yaklaşık olarak her 48 saat gereklidir. Tüm medya olduğunu, dikkatli olunmekanik olarak zayıf Puramatrix bütünlüğünü korumak için, ekleme altına eklendi. Agaroz Nöronal uygulamalar için, agaroz% 1'lik bir büyüme ortamında çözüm seyreltilmiş ve agaroz tamamen eriyene kadar (~ 1 saat) 60 ° C su banyosuna yerleştirilir. Çözüm, sonra 1 mcg / mL çözünen laminin ile tamamlanmaktadır. Tüm aşırı medya PEG boşlukları uzaklaştırılmalıdır. Agaroz PEG boşlukları dışına taşırmadan boş alanı doldurmak için eklenir. Boşluğun hacmi bağlı olarak genellikle 1 mcL inşa başına kullanılan ~. Büyüme ortamının 1.5 mL 6 plaka önceden soğutulmuş (8 ° C), ve agaroz içeren ekler agaroz izin soğutulmuş ortama aktarılır ve 8 ° C'de en az üç dakika boyunca buzdolabında muhafaza edilir jel. Son olarak, ekler, 1.5 ml (37 ° C), önceden ısıtılmış büyüme orta transfer ve 37 kuvöz muhafaza ° C, her 48 saatte gerekli ortam değişiklikleri ile. 3. Çift Hidrojel 3D Hücre Kapsüllemesi Çift hidrojel encapsulation kendi montaj jel kullanırken uygundur. Photocrosslinkable jel, bu durumda PEG, örneğin Puramatrix veya agaroz, öz-montaj jel geometrik tanıtımı için yapısal bir destek olarak hizmet vermektedir. Bu yöntemlerden bazıları, özellikle photomask jel ve seçim türü, özellikle istediğiniz uygulamayı bağlı olacaktır. DMD uygun bir maske yükleyin. Bizim uygulama, hücre hayatta kalmak için, biz sadece hücre görüntüleme yardım Puramatrix silindirik bir sunum seçti. Araştırmacılar, hücre sinyal eğitim kemotaktik moleküllerin difüzyon izin bölmeli bir geometri ilginizi çekebilir. Ayrıca, bir arter kaba bir yaklaşım, kan damarı araştırma olası uygulama temsil etmek için gösterilmiştir. Yağmur X kaplı slayt DMD altında polyester hücre kültürü Yağmur X ile insert, yer ve duvarları davranın. Eklemek için polimerizasyon orta 500 mcL ekleyin. 55 saniye süreyle UV ışınlarına maruz PEG crosslinking uyarır. Steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. PEG boşlukları tüm Fazla medyayı çıkartın. Pelet içine istenilen yoğunlukta hücre aşağı spin. Bakım Puramatrix bir tuz çözeltisi ile temas halinde hemen kendini montaj başlar başlamaz, önce karıştırma hücre pelletini tüm orta kaldırmak için alınması gerekir. Askıya Alma steril H 2 O seyreltilmiş% 0,15 Puramatrix içinde hücrelerin% 10 sakaroz ile desteklenmelidir. PEG içinde boşluklar içinde Puramatrix / hücre / sakaroz karışımı enjekte edilir. 1.5 mL eklemek altında büyümenin orta ekleyin ve bir saat için kuvöz içinde jel izin. Bir saat sonra ortam değiştirin, ve bundan sonra her 48 saatte ~. 4. Tek Hidrojel 3D Hücre Kapsüllemesi Tek bir hidrojel kapsülleme hücreleri photocrosslinkable hidrojel içinde incelenebilir bir durum için uygun olacaktır. DMD uygun bir maske yükleyin. Hücre sağkalım çalışmalar için, yine bir silindir temsil edecek bir temel dairesel maske seçti. Metodu 4 gösterilen benzer Maskeler tekrar uygun bir araştırma alanı için uygulanabilir. Yağmur X kaplı slayt DMD altında polyester hücre kültürü Yağmur X ile insert, yer ve davranın. Herhangi istenilen konsantrasyonda hücreler homojen dağılımını sağlamak için iyice karıştırılması,% 10 PEG solüsyonu direkt olarak ilave edilebilir. Eklemek için polimerizasyon orta 500 mcL ekleyin. 55 saniye süreyle UV ışınlarına maruz PEG crosslinking uyarır. Steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep ile üç kez yıkayın. Değişen her ~ 2 gün, altına ve üstüne ekleme bir büyüme ortamı ile doldurun. 5. İnce Film Hidrojel Polimerizasyon DMD uygun bir maske yükleyin. Yağmur X kaplı slayt kollajen kaplı polyester hücre kültürü Yağmur-X ile insert, yer ve davranın. Insert (6 plaka ekler ~ 250-300 mcL) sadece alt kapağı için yeterli polimerizasyon orta ekleyin. Medya, oda sıcaklığında 30-45 dakika ekleme membran girmesine izin verin. Mikropipet veya Kimwipe insert fazla polimerizasyon orta çıkarın. Eklemek tamamen alt kapağı için yeterli miktarda UV-şeffaf yağ ekleyin. Eklemek polimerizasyon orta doyurarak ekleme membran üzerinde ayrı bir tabaka oluşturur petrol için, yeterince uzun süre oda sıcaklığında 15-30 dakika oturmak için izin verin. DMD altında ekleme ve slayt yerleştirin. UV ışınlarına maruz kalma PEG crosslinking neden. Çünkü PEG tabakasının inceliği, crosslinking DMD 5.0 Watt / cm 2 olayın en az 15 saniye içinde tamamlanmalıdır. <li> Steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep eklemek üç kez yıkayın. (Yağlı bir kalıntı sebat bir endişe ise, Tween 20 (% 1) gibi hafif bir deterjan yıkama tamponu eklenebilir.) 6-iyi doku kültürü plakası ekleme saklayın. Istenilen konsantrasyonda askıda hücrelere büyüme orta ekle ve istenilen hücre yoğunluğu, hücre kültürü eklemek içinde hücre süspansiyonu elde etmek için yeterli bir hacmi pipetle. Sonra, tamamen hücre canlılığını korumak için (~ 1.5 mL) eklemek için aşağıdaki yeterli büyüme ortamı ekleyin. 48 saat geçtikten sonra herhangi bir unadhered hücreleri çıkarmak için, steril DPBS ve% 1 Kalem-Strep eklemek üç kez yıkayın. Yaklaşık olarak her 48 saatte bir ortam değiştirin. 6. Temsilcisi Sonuçlar Çift hidrojel örnekleri içeren DRG eksplantlar Şekil 2'de gösterilmiştir oluşturur. Hücresel göç ve neurite uzantısı hücre müsamahakar çift hidrojel bölgeye inşa sınırlı olduğunu dikkat edin. Şekil 3 çift hidrojel yapıları içinde benzer bir kapsüllü ayrışmış hücreleri gösteriyor. DMD photomask dinamik yapısı nedeniyle, kapsülleme kullanılabilir geometri, optik boyutları ve çözünürlüğü sınırlıdır. Hücre kapsülleme tek bir photopolymerizable hidrojel, PEG içinde de mümkün olduğunu, ölü / canlı canlılığı testi Şekil 4'te kanıtladığı gibi yapıldı. PEG içinde kapsüller PEG sinir hücreleri için ideal bir ortamı temsil etmiyor, sadece bir örnek olarak geliyordu. Bu nedenle, PEG yapıları gerçekleştirilen hücre canlılığı anlaşılır düşük. Son olarak, ince PEG filmler, hücre kültürü ekler, hücre yapışması için desenli sınırlayıcı bir tabaka olarak kullanan örnekler Şekil 5'te gösterilmiştir. Ayrıca, olası bir "kötü" sonuçlarının örnekleri Şekil 6'da sunulmaktadır. Sonuçlar, olası kullanımlarının laboratuvarda geliştirilen yöntemlerden yalnızca küçük bir bölümünü temsil eder. Onlar bizim yaklaşımımız kolaylığı, çok yönlülük ve canlılığı göstermek amacıyla, araştırmacılar kendi olası adaptasyonlar geliştirmek için "prensip kanıtı" olarak tedavi edilebilir. Şekil 1 fotolitografi için kullanılan ışık yolu şematik gösterimi. Ankastre: 45 ° ve 24 ° ayna dizi uçağın altında bir açıyla DMD UV ışık yanar. Şekil 2 çift hidrojel yapıları içeren DRG Etiketli büyümesi ve yayılması. AD), Beta III tubulin (yeşil), DAPI boyanan hücre çekirdeğine (mavi) ile etiketlenmiş neurites ile polimerize PEG yapıları (gri) tasvir görüntüler. DRG eksplantlar Puramatrix bulunan ve çatallanma (ler) doğru büyüyen neurites desen dairesel bölgelerinde bulunmaktadır. Şekil 3 büyüme ortamında 48 saat sonra canlı bir hücre belirteci ile Calcein AM etiketli hücreleri içeren Çift hidrojel oluşturur. AD) Çeşitli PEG şekiller, ayrışmış DRG nöron (~ 5×10 3 hücre / ml) içeren Puramatrix ile dolu. Şekil 4 Tek hidrojel içeren büyüme ortamında 24 saat sonra (5×10 3 hücre / ml) ethidium homodimer-1 (kırmızı) ile etiketlenmiş Calcein AM (yeşil) ve ölü hücreleri ile etiketlenmiş canlı hücreler inşa. Şekil 5 Hücre kısıtlayıcı PEG ayrışmış hücrelerin seçici geçirgen destekleyen kollajen kaplı membran uymak için bir "test deseni" kullanılarak ince bir film olarak polimerize. Ethidium homodimer-1 (kırmızı) ile ölü hücrelerden etiketli ise A, B) Canlı hücreler, Calcein AM (yeşil) ile 48 saat sonra etiketlenir. Minimum hücre adezyon ince PEG filmi içeren alan oluşur. Şekil 6 istenmeyen sonuçlar Temsilcisi görüntüleri. A) PEG Kısmi polimerizasyon, kullanışsız bir PEG yapı. Yanlış polimerizasyon menisküs, ön-polimer orta, yetersiz miktarda polimerizasyon orta, yetersiz UV ışınlarına maruz kalma ya da optik yanlış odak varlığı nedeniyle oluşabilir. B) Beta III tubulin (yeşil), DAPI boyanan hücre çekirdeğine (mavi) ile etiketlenmiş neurites ile polimerize PEG yapıları (gri) tasvir Resim. Neurites desenli PEG kanalların dışında da büyümeyi başardık. Bu durum sık sık oluşur Puramatrix enjeksiyon sırasında PEG kısmının üstüne taşıyor.