Protocol voor Recombinant RBD-based SARS Vaccins: Eiwit Voorbereiding, vaccinatie van dieren en het onschadelijk maken Detectie

1. Recombinant SARS-CoV RBD eiwitpreparaat Bereid calciumfosfaat transfectie reagens 2X HBS buffer voorbereiding: Meng 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, en 13,0 g HEPES. Pas de pH op 7,00 en brengen het totale volume tot 1000 ml in gedestilleerd water. Na het filteren van de oplossing voor sterilisatie, hoeveelheid en op te slaan bij -20 ° C. Hint: Een wijziging van de pH-waarde zou invloed hebben op de transfectie resultaten. Zo is het raadzaam om verschillende pH-waarden te testen rond 7.00 (bijvoorbeeld 6.99, 7.00 of 7.01) en de beste voor de transfectie met behulp van de onderstaande methode geïntroduceerd te vinden. 2.5 M CaCl 2 bereiding: Voeg 73,5 g CaCl 2 * 2H 2 O tot gedistilleerd water in een uiteindelijk volume van 200 ml. Filtreer de oplossing en bewaar bij -20 ° C. Recombinant plasmide transfectie en eiwit zuivering Split 293T cellen bij 50-70% confluentie 24 uur voor transfectie. Groeien cellen in T-175 cm 2 weefselkweek flessen in 40 ml DMEM met 10% hitte-geïnactiveerd (HI) FBS en 1% penicilline / streptomycine (P / S) bij 37 ° C in 5% CO 2. Alle transfectiereagentia moet worden gebracht tot kamertemperatuur voordat transfectie. Deze reagentia zijn 2X HBS, 2,5 M CaCl 2, dih 2 O, en rRBD plasmide 6. Hint: De laatste recombinant plasmide construct gebruikt voor proteïne-expressie moet een signaal peptide bevatten om de uitscheiding van geuit recombinante eiwitten ervoor te zorgen dat de cultuur supernatant. Een 6x Zijn tag kunnen worden toegevoegd aan de C-terminal van de tot expressie gebrachte eiwit voor een gemakkelijke reiniging. Bereid een 50 ml (A) en een 15 ml (B) BD Falcon buis, en voeg reagentia aan de buizen zoals aangegeven in tabel 1. Voeg 2X HBS buffer om buis A. In buis B, voeg 2.5M CaCl 2 en rRBD plasmide, en breng het volume op de eis in dih 2 O. A. Een T-175 cm 2 weefselkweek kolf (4000 pi / fles): voor te bereiden op rRBD expressie Een buis Buis B 2X HBS 2000 pi 2.5M CaCl 2 200 pi rRBD plasmide DNA 40 ug Dih 2 O te 2000 pi B. Een 100-mm petrischaal (1000 pi / gerecht): voor te bereiden op SARS pseudovirus productie Een buis Buis B 2X HBS 500 pL 2.5M CaCl 2 50 uL Plasmide DNA SARS-CoV S 5 microgram HIV-1 plasmide (pNL4-3.luc.RE) 5 microgram Dih 2 O te 500 pL Tabel 1. Transfectie mengsel voorbereiding en volumes De volumes in tabel 1 zijn voor een transfectie-eenheid. Als er meer kolven of schotels worden gebruikt voor de transfectie, dienovereenkomstig aan te passen volumes. Voeg de DNA-calcium-oplossing in buis B in buis A in een druppelsgewijze manier, met behoud van een constante en voorzichtig mengen in een vortex. Laat het mengsel op kamertemperatuur komen voor 20-30 minuten. De sleutel voor succesvolle calciumfosfaat transfectie is afhankelijk van de grootte en de vorm van de gevormde neerslag. Daarom moet het mengsel voortdurend en langzaam worden gevortext aan deze eis te voldoen, en als gevolg daarvan, transfectie efficiëntie te verbeteren. Voeg het mengsel in een druppelsgewijs en zelfs manier in 293T-cellen (4000 pi / fles). Cultuur-cellen in de broedstoof bij 37 ° C in 5% CO 2. Vervang het kweekmedium met verse serumvrij OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium (50 ml / fles) 80-10 uur na transfectie. Blijf cultuur cellen voor twee dagen in dezelfde staat. Verzamel supernatant bevat uitgedrukt rRBD eiwit 72 uur na transfectie. Centrifugeer bij 6000 rpm gedurende 15 min naar cel vuil te verwijderen. Voeg proteaseremmer cocktail om de verzamelde supernatant en bewaar bij 4 ° C gedurende de nacht. Op de volgende dagen, te zuiveren rRBD recombinant eiwit uit het kweeksupernatant gebruik van Ni-NTA Superflow volgende instructies van de fabrikant. Concentreer gezuiverde eiwit met behulp van Amicon Ultra -15 concentratie buizen. Na de eiwitconcentratie,Voeg PBS met de concentratie en centrifugeer weer naar imidazol te verwijderen elutiebuffer. Bereken eiwitconcentratie en op te slaan gezuiverd eiwit bij -80 ° C tot gebruik. 2. Muis Immunisatie en Sample Collection Pre-warm Sigma adjuvant systeem (SAS) tot 40-45 ° C volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 1 mL PBS per flesje en meng. Bereid eiwit-adjuvante emulsie volgens het protocol in tabel 2. Pipetteer berekend rRBD eiwit in een 1,5 ml buis. Voeg gelijk volume van SAS adjuvant aan de buis en de vortex krachtig voor 2-3 min om emulsie te vormen. Hint: De volumes in tabel 2 zijn voor een muis. Het volume aanpassen op basis van de feitelijk gebruikte muis nummers. Voor elke groep, Meng de eiwitten en adjuvant vereist voor elke vaccin. Altijd bereidt u een extra steekproef voor de vaccinatie om de nauwkeurigheid te garanderen. Groep 1 st vaccin (200 ul / muis) 2 e vaccin (200 ul / muis) 3 e vaccin (200 ul / muis) rRBD eiwit 20 pg eiwit in PBS (100 pi) + 100 pi SAS 10 ug eiwit in PBS (100 pi) + 100 pi SAS 10 ug eiwit in PBS (100 pi) + 100 pi SAS PBS-controle 100 pi PBS + 100 ul SAS 100 pi PBS + 100 ul SAS 100 pi PBS + 100 ul SAS Tabel 2. Mouse immunisatieprotocol Subcutaan prime-immuniseren vrouwelijke BALB / c muizen (4-6 weken oud, 5 muizen / groep), en boost tweemaal met rRBD en SAS zoals aangegeven in tabel 2. Gebruik PBS groep als de controle. De site voor subcutane injecties meestal gekozen is de losse huid tussen de schouderbladen. Als alternatief wordt de ventrale buik vaak gebruikt, omdat het gemakkelijker is om te injecteren, en mag de lekkage van de injectieplaatsen te observeren. Wanneer herhaalde doses vaccins worden gebruikt, is het gemakkelijk om te kiezen verschillende injectieplaatsen, het voorkomen van potentiële lokale huidreacties. Bleed muizen via retro-orbitale met verdoving voor immunisatie en 10 dagen na elke vaccinatie, en warmte sera bij 56 ° C gedurende 30 minuten tot het complement te inactiveren. Bewaar muis sera bij -20 ° C tot gebruik. 3. Neutralisatie Detectie met behulp van Pseudovirus neutralisatie assay Bereid SARS pseudovirus Split 293T cellen in 100 mm weefselkweek petrischalen (2×10 6 cellen / schaaltje) 16 uur voor transfectie, en te groeien cellen zoals hierboven. Bereid transfectiereagentia zoals aangegeven in tabel 1. Co-transfecteren een plasmide coderend voor SARS-CoV S eiwit en een plasmide coderend voor Env-defect is, luciferase-expressie HIV-1 genoom (pNL4-3.luc.RE) met behulp van calciumfosfaat transfectie reagens. Vervangen door medium met 10 ml vers DMEM met 10% FBS en 1% P / S 80-10 uur na transfectie. Verzamel supernatant met SARS pseudovirus 72 uur na transfectie. Filter pseudovirus door een 0,45 urn filter. Aliquot en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. SARS pseudovirus neutralisatie assay Split 293T cellen die SARS-CoV receptor ACE2 (ACE2/293T) op 10 4 cells/100 ul / putje in 96-well kultuurplaten 16 uur vóór infectie. Verdunnen SARS pseudovirus 2-voudig om het virus titer te detecteren in ACE2/293T cellen. Serieel te verdunnen muis sera in 96-well kultuur platen, en voeg gelijk volume van het gestelde SARS pseudovirus. Preincubate de platen bij 37 ° C gedurende 1 uur Na de incubatie, voeg 100 ul van de sera-pseudovirus mengsel aan ACE2/293T cellen, en blijven cellen groeien bij 37 ° C in 5% CO 2. Later toe te voegen verse DMEM 24 uur. Volledig kweeksupernatanten te verwijderen van de platen 72 uur na infectie. Voeg 1X luciferase celkweek lysis reagens (60 ul / putje), en het bevorderen van cel-lysis met een constante schudden van de platen gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur. Transfer cellysaten (50 ul / putje) in luminometer platen (Microfluor 96-well platen). Voeg luciferase substraat (50 ul / putje) opgenomen in luciferase assay systeem en detecteert de relatieve luciferase-activiteit in de Ultra 384 luminometer. Bereken SARS pseudovirus neutralisatie titer en aanwezig als 50% neutraliserende antilichamen titer (NT 50) 6.