Protocolo para vacinas recombinantes RBD baseado SARS: Preparação de proteínas, Vacinação Animal e Detecção de Neutralização

1. Recombinante SARS-CoV Preparação Protein RBD Prepare cálcio reagentes de transfecção de fosfato 2X tampão HBS preparação: Misture 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, e 13,0 g de HEPES. Ajustar o pH a 7,00 e educação de volume total para 1000 mL em água destilada. Depois de filtrar a solução para alíquota de esterilização, e armazená-lo a -20 ° C. Dica: Qualquer variação do valor de pH afetaria os resultados transfecção. Assim, é aconselhável testar vários valores de pH em torno de 7,00 (por exemplo, 6,99, 7,00, ou 7,01) e encontrar o melhor para a transfecção usando o método introduzido abaixo. 2,5 M CaCl 2 preparação: Adicionar 73,5 g de CaCl 2 * 2H 2 O em água destilada em um volume final de 200 mL. Filtrar a solução e armazenar a -20 ° C. Transfecção do plasmídeo recombinante e proteína de purificação Dividir células 293T em 50-70% 24 h antes de confluência de transfecção. Cultivar células em T-175 cm 2 frascos de cultura de tecidos em 40 mL DMEM contendo 10% inativado pelo calor (HI) FBS e 1% Penicilina / Estreptomicina (P / S) a 37 ° C em 5% CO 2. Todos os reagentes de transfecção deve ser trazido à temperatura ambiente antes de transfecção. Estes reagentes incluem 2X HBS, 2.5M CaCl 2, Dih 2 O, e rRBD 6 plasmídeo. Dica: O plasmídeo recombinante final de construção usado para a expressão da proteína deve conter um peptídeo sinal para garantir a secreção de proteínas recombinantes expressas para o sobrenadante da cultura. A tag Sua 6x pode ser adicionado ao C-terminal da proteína expressa para a purificação fácil. Prepare uma mL 50 (A) e um 15 mL (B) BD tubo Falcon, e adicionar os reagentes aos tubos, como indicado na Tabela 1. Adicionar 2X tampão HBS para A. tubo no tubo B, adicionar 2,5 milhões de CaCl 2 e rRBD plasmídeo, e levar o volume para a exigência da Dih 2 O. A. Um T-175 cm 2 frasco de cultura de tecidos (4000 mL / frasco): preparar para a expressão rRBD Um tubo Tubo B 2X HBS 2000 mL 2.5M CaCl 2 200 mL DNA plasmídeo rRBD 40 mcg Dih 2 O para 2000 mL B. Um de 100 mm placa de Petri (1000 mL / prato): preparar-se para SARS produção pseudovirus Um tubo Tubo B 2X HBS 500 mL 2.5M CaCl 2 50 mL DNA plasmídeo SARS-CoV S 5 mg HIV-1 plasmídeo (pNL4-3.luc.RE) 5 mg Dih 2 O para 500 mL Tabela 1. Preparação da mistura Transfection e volumes Os volumes listados na Tabela 1 são para uma unidade de transfecção. Se frascos mais ou pratos são utilizados para a transfecção, ajustar volumes em conformidade. Adicionar a solução de DNA de cálcio no tubo B no tubo A de uma forma gota a gota, mantendo constante e suave a mistura em um vórtice. Deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 20-30 min. A chave para o sucesso de transfecção de fosfato de cálcio depende do tamanho e forma do precipitado formado. Assim, a mistura deve ser constantemente agitadas e, lentamente, para cumprir este requisito e, como conseqüência, melhorar a eficácia de transfecção. Adicione a mistura de uma forma gotas e até mesmo em células 293T (4000 mL / frasco). Células de cultura em estufa a 37 ° C em 5% CO 2. Substituir o meio de cultura com novas OPTI-MEM eu sem soro Médio Reduzido-Serum (50 mL / frasco) 8-10 h pós-transfecção. Continuar a células de cultura por mais dois dias na mesma condição. Recolher o sobrenadante contendo proteínas expressas rRBD 72 h pós-transfecção. Centrifugar a 6000 rpm por 15 min para remover restos celulares. Adicionar coquetel inibidor de protease para o sobrenadante coletado e armazenar a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, purificar proteínas recombinantes rRBD do sobrenadante da cultura através de instruções de Ni-NTA fabricante Superflow seguinte. Concentre-se proteína purificada usando Amicon Ultra tubos concentração -15. Após a concentração de proteína,PBS adicionar aos tubos de concentração e centrifugar novamente para remover imidazol em tampão de eluição. Calcular a concentração de proteína e armazenar proteína purificada a -80 ° C até o uso. 2. Imunização mouse e Coleta de Amostra Pré-aquecer Sigma sistema adjuvante (SAS) para 40-45 ° C de acordo com instruções do fabricante. Adicionar 1 mL de PBS por frasco e misturar bem. Prepare a proteína adjuvante emulsão de acordo com o protocolo na Tabela 2. Pipeta calculada proteína rRBD em um tubo de 1,5 mL. Adicionar igual volume de adjuvante SAS para o tubo e vortex vigorosamente por 2-3 min para formar emulsão. Dica: Os volumes listados na Tabela 2 são para um mouse. Ajustar volumes de acordo com os números do mouse real usado. Para cada grupo, misture as proteínas e adjuvante necessários para cada vacina. Sempre preparar uma amostra suplementar para a vacinação para garantir a precisão. Grupo 1 ª vacina (200 mL / rato) 2 ª vacina (200 mL / rato) 3 ª vacina (200 mL / rato) proteína rRBD 20 g de proteína em PBS (100 mL) + 100 mL SAS 10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS 10 g de proteína em PBS (100 L) + 100 mL SAS PBS controle 100 mL PBS + 100 mL SAS 100 mL PBS + 100 mL SAS 100 mL PBS + 100 mL SAS Tabela 2. Protocolo de imunização do rato Por via subcutânea prime-imunizar fêmeas BALB / c (4-6 semanas de idade, cinco ratos / grupo), e aumentar duas vezes com rRBD e SAS, conforme indicado na Tabela 2. Use PBS grupo como o controle. O site para injeções subcutâneas geralmente escolhido é a pele solta entre as omoplatas. Alternativamente, o abdômen ventral é comumente usado, porque é mais fácil para injetar, e pode observar qualquer vazamento dos locais de injeção. Quando repetidas doses de vacinas são usadas, é fácil selecionar os locais de injeção diferentes, prevenindo potenciais reacções cutâneas locais. Sangrar camundongos via retro-orbital com anestésico antes da imunização e 10 dias após cada vacinação, soros e calor a 56 ° C por 30 min para a inativação do complemento. Loja do mouse soros a -20 ° C até o uso. 3. Detecção de neutralização usando ensaio de neutralização Pseudovirus Prepare pseudovirus SARS Dividir células 293T em 100 milímetros de tecido placas de cultura de petri (2×10 6 células / prato) 16 h antes da transfecção, as células crescem e como acima. Preparar reagentes de transfecção, conforme indicado na Tabela 1. Proteína co-transfecção um plasmídeo SARS-CoV S e um plasmídeo Env-defeituoso, luciferase expressando o genoma do HIV-1 (pNL4-3.luc.RE), utilizando reagentes de transfecção de cálcio fosfato. Substituir médio com 10 mL fresco DMEM contendo 10% FBS e 1% P / S 10/08 h pós-transfecção. Recolher o sobrenadante contendo SARS pseudovirus 72 h pós-transfecção. Pseudovirus filtro através de um filtro mM 0,45. Alíquotas e armazenar a -80 ° C até o uso. SARS ensaio de neutralização pseudovirus Dividir células 293T expressar SARS-CoV receptor ECA2 (ACE2/293T) a 10 4 cells/100 mL / poço em placas de 96 poços de cultura de tecido 16 h antes da infecção. Diluir pseudovirus SARS por 2 vezes para detectar o título do vírus nas células ACE2/293T. Serialmente diluída em soro de rato placas de 96 poços de cultura de tecidos, e adicionar igual volume de titulado pseudovirus SARS. Pré-incubação das placas a 37 ° C por 1 h. Após a incubação, adicionar 100 mL da mistura de soros para as células-pseudovirus ACE2/293T, e continuam a crescer as células a 37 ° C em 5% CO 2. Adicionar nova DMEM 24 h mais tarde. Remover completamente o sobrenadante da cultura de placas de 72 h pós-infecção. Adicionar 1X luciferase reagente de lise celular cultura (60 mL / poço), e promover a lise celular com constante agitação de placas por 1-2 h à temperatura ambiente. Transferência de lisados ​​celulares (50 mL / poço) em placas luminômetro (Microfluor placas de 96 poços). Adicionar substrato luciferase (50 mL / poço), incluído no sistema de análise luciferase, e detectar a atividade luciferase relativa no luminômetro 384 Ultra. Calcule SARS título de neutralização pseudovirus e presente como título de anticorpos neutralizantes 50% (NT 50) 6.