Протокол Рекомбинантный РосБР основе вакцины атипичной пневмонии: белковый препарат, вакцинация животных и нейтрализации Обнаружение

1. Рекомбинантный SARS-коронавирус РосБР белковый препарат Подготовка фосфата кальция трансфекции реагента 2X HBS буфера приготовления: Смешать 16 г хлористого натрия, 0,4 г Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, и 13,0 г HEPES. Отрегулируйте рН до 7,00 и воспитывать общий объем до 1000 мл в дистиллированной воде. После фильтрации раствор для стерилизации, аликвоты и хранить его при температуре -20 ° C. Подсказка: Любые изменения рН повлияет трансфекции результаты. Таким образом, желательно, чтобы проверить несколько значений рН около 7.00 (например, 6,99, 7,00 или 7,01) и найти лучший для трансфекции с использованием метода представлены ниже. 2,5 М CaCl 2 препарата: Добавить 73,5 г CaCl 2 * 2H 2 O в дистиллированной воде в конечном объеме 200 мл. Фильтры решение и хранить при температуре -20 ° C. Рекомбинантные плазмиды трансфекции и очистки белков Сплит 293T клеток на 50-70% слияния 24 часов до трансфекции. Рост клеток в Т-175 см 2 культуре ткани колбы в 40 мл DMEM, содержащей 10% тепла инактивированной (HI) FBS и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S) при 37 ° С в 5% СО 2. Все трансфекции реагенты должны быть доведены до комнатной температуры перед трансфекции. Эти реагенты включают 2X HBS, 2,5 CaCl 2, DIH 2 O, и rRBD плазмиды 6. Подсказка: окончательное рекомбинантной плазмиды построить для экспрессии белка должно содержать сигнальный пептид для обеспечения секреции выразил рекомбинантных белков в культуру супернатанта. 6x теги Его могут быть добавлены в C-терминал выразил белка для легкой очистки. Подготовьте 50 мл () и один 15 мл (B) BD Сокол трубки, а также добавлять реагенты для труб, как это указано в таблице 1. Добавить 2X HBS буфера в трубке А. В трубке В, добавить 2,5 М CaCl 2 и rRBD плазмиды, и довести объем потребности в DIH 2 O. А. Один Т-175 см 2 культуре ткани колбу (4000 мкл / флакон): подготовиться к rRBD выражение Труба Труба B 2X HBS 2000 мкл 2,5 М CaCl 2 200 мкл rRBD ДНК плазмиды 40 мкг DIH 2 O в 2000 мкл B. Один 100-мм чашки Петри (1000 мкл / блюдо): подготовить для производства pseudovirus атипичной пневмонии Труба Труба B 2X HBS 500 мкл 2,5 М CaCl 2 50 мкл Плазмиды SARS-коронавирус S ДНК 5 мкг ВИЧ-1-плазмиды (pNL4-3.luc.RE) 5 мкг DIH 2 O в 500 мкл Таблица 1. Трансфекция подготовки смеси и объемы Объемы перечисленных в таблице 1, для одного трансфекции единицы. Если более колбах или блюда используются для трансфекции, отрегулировать объемы соответственно. Добавить ДНК-кальциевый раствор в трубке B в трубку в каплям, сохраняя при этом постоянную и нежный перемешивания в вихре. Пусть смесь сидеть при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Ключ для успешной трансфекции фосфатом кальция зависит от размера и формы осадок. Таким образом, смесь следует перемешать постоянно и медленно, чтобы выполнить это требование, и, как результат, повышение эффективности трансфекции. Добавить в смесь по каплям и даже образом в клетках 293T (4000 мкл / флакон). Культуры клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% СО 2. Замените культуральной среде со свежей бессывороточной OPTI-MEM я уменьшенного сыворотки среднего (50 мл / флакон) 8-10 ч после трансфекции. Продолжайте культуры клеток в течение еще двух дней в том же состоянии. Сбор супернатант, содержащий выразил rRBD белка 72 ч после трансфекции. Центрифуга при 6000 оборотов в минуту в течение 15 минут, чтобы удалить ячейку мусора. Добавить коктейль ингибиторов протеаз, чтобы собранные супернатант и хранить при температуре 4 ° С в течение ночи. На следующий день, очищают rRBD рекомбинантного белка из супернатанта культуры, используя инструкции Ni-NTA Superflow следующие производителя. Концентрат очищенный белок использованием Amicon Ультра труб -15 концентрации. После концентрации белка,добавить PBS с концентрацией труб и центрифуга снова, чтобы удалить имидазола в элюции буфера. Рассчитайте концентрации белка и хранить очищенный белок при температуре -80 ° С до использования. 2. Иммунизация мышей и взятием проб Предварительно теплой Sigma адъювантной системы (SAS) до 40-45 ° С в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте 1 мл PBS на флакон и тщательно перемешать. Подготовка белка адъювантной эмульсии в соответствии с протоколом в таблице 2. Внесите рассчитывается rRBD белка в 1,5 мл трубки. Добавить равный объем SAS адъювантной к трубке и вихревые энергично в течение 2-3 мин с образованием эмульсии. Подсказка: объемы перечисленных в таблице 2 для одной мыши. Отрегулируйте объемах в соответствии с фактической численности мыши используется. Для каждой группы, смешать белки и адъювантной необходимых для каждой вакцины. Всегда готовьте один дополнительный образец для вакцинации для обеспечения точности. Группа 1-й вакцины (200 мкл / мышь) 2-й вакцины (200 мкл / мышь) 3-й вакцины (200 мкл / мышь) rRBD белка 20 мкг белка в PBS (100 мкл) + 100 мкл SAS 10 мкг белка в PBS (100 мкл) + 100 мкл SAS 10 мкг белка в PBS (100 мкл) + 100 мкл SAS PBS контроль 100 мкл PBS + 100 мкл SAS 100 мкл PBS + 100 мкл SAS 100 мкл PBS + 100 мкл SAS Таблица 2. Мышь иммунизации протокола Подкожно премьер-иммунизации женщин BALB / с мышами (4-6 недель, 5 мышей / группу), и увеличить в два раза с rRBD и SAS, как указано в таблице 2. Используйте PBS группе контроля. Сайт для подкожных инъекций обычно выбирают является свободной кожи между лопатками. Кроме того, вентральной брюшной полости обычно используется, потому что это легче внедрить, и может наблюдать любой утечки из места инъекций. При повторных доз вакцины используются, легко выбирать различные сайты инъекции, предотвращая потенциальные местные кожные реакции. Bleed мышей через ретроорбитального с анестезией до иммунизации и через 10 дней после каждой вакцинации и сывороток тепла при 56 ° С в течение 30 мин для инактивации комплемента. Магазин мыши сыворотки при температуре -20 ° С до использования. 3. Нейтрализация Обнаружение использованием Пробирной Pseudovirus Нейтрализация Подготовка ОРВИ pseudovirus Сплит 293T клеток в 100 мм культуре ткани чашках Петри (2х10 6 кл / блюдо) 16 часов до трансфекции, и растут клетки как указано выше. Подготовка реагентов трансфекции, как указано в таблице 1. Сотрудничество трансфекции плазмидой, кодирующей SARS-коронавирус S белка и плазмиды, кодирующей ENV-неисправен, люциферазы, экспрессирующих ВИЧ-1 генома (pNL4-3.luc.RE) с помощью фосфата кальция трансфекции реагента. Замените среду с 10 мл свежей DMEM, содержащей 10% FBS и 1% P / S 8-10 ч после трансфекции. Сбор супернатант, содержащий ОРВИ pseudovirus 72 ч после трансфекции. Фильтры pseudovirus через 0,45 мкм фильтр. Алиготе и хранить при температуре -80 ° С до использования. Атипичной пневмонии pseudovirus нейтрализации анализа Сплит 293T клеток, экспрессирующих SARS-коронавирус рецепторов ACE2 (ACE2/293T) на 10 4 cells/100 мкл / лунку в 96-луночных культуры тканей 16 ч до заражения. Развести ОРВИ pseudovirus по 2-кратный для обнаружения титра вируса в ACE2/293T клеток. Серийно разбавленный мыши сывороток в 96-луночных культуре тканей, а также добавить равный объем титруемой pseudovirus атипичной пневмонии. Preincubate пластин при 37 ° С в течение 1 ч. После инкубации, добавьте 100 мкл сыворотки-pseudovirus смеси ACE2/293T клеток, и продолжают расти клетки при 37 ° С в 5% СО 2. Добавьте свежие DMEM 24 часов спустя. Полностью удалить культуры супернатантов из пластин 72 ч после заражения. Добавить 1X люциферазы культуре клеток лизис реагента (60 мкл / лунку), а также содействовать лизиса клеток с постоянной тряски пластин в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Передача клеточных лизатов (50 мкл / лунку) в люминометра пластин (Microfluor 96-луночных планшетах). Добавить люциферазы подложки (50 мкл / лунку), включенных в люциферазы системы анализа и выявления относительной активности люциферазы в Ультра 384 люминометра. Рассчитать ОРВИ pseudovirus титр нейтрализации и присутствует в виде 50% нейтрализации титр антител (NT 50) 6.