Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

1. Recombinante Préparation du SARS-CoV protéines RBD Préparer réactif de transfection de phosphate de calcium Préparation de 2X tampon HBS: Mélanger 16 g de NaCl, 0,4 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, et 13,0 g d'HEPES. Ajuster le pH à 7,00 et amener le volume total à 1000 ml d'eau distillée. Après filtration de la solution pour la stérilisation, aliquote et le stocker à -20 ° C. Astuce: Toute variation de la valeur du pH aurait une incidence sur les résultats de la transfection. Ainsi, il est conseillé de tester plusieurs valeurs de pH autour de 7,00 (par exemple, 6,99, 7,00, ou 7,01) et de trouver le meilleur pour la transfection en utilisant la méthode présentée ci-dessous. 2,5 M CaCl 2 préparation: Ajouter 73,5 g de CaCl 2 * 2H 2 O à l'eau distillée dans un volume final de 200 ml. Filtrer la solution et conserver à -20 ° C. Recombinant transfection plasmidique et purification des protéines recombinantes Fractionner les cellules 293T à 50-70% de confluence 24 h avant la transfection. Cultiver des cellules de T-175 cm 2 flacons de culture tissulaire dans 40 ml de DMEM contenant 10% inactivés par la chaleur (HI) FBS et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) à 37 ° C dans 5% de CO 2. Tous les réactifs de transfection devrait être porté à la température ambiante avant la transfection. Ces réactifs comprennent 2X HBS, 2.5M CaCl 2, Dih 2 O, et rRBD 6 plasmide. Astuce: Le plasmide final recombinant de construction utilisé pour l'expression protéique doit contenir un peptide signal pour assurer la sécrétion de protéines recombinantes exprimées dans le surnageant de culture. Un 6x Son étiquette peut être ajoutée à la C-terminale de la protéine exprimée pour la purification facile. Préparer un 50 ml (A) et un 15 ml (B) BD Falcon tube, et ajouter des réactifs dans les tubes comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter 2X tampon HBS à A. Dans le tube tube B, ajouter 2,5 M CaCl 2 et rRBD plasmide, et de porter le volume à l'exigence de Dih 2 O. A. Un T-175 cm 2 flacon de culture tissulaire (4000 ul / flacon): se préparer pour l'expression rRBD Un tube Le tube B 2X HBS 2000 uL 2,5 M CaCl 2 200 uL rRBD ADN plasmidique 40 ug Dih 2 O 2000 uL B. Une de 100 mm boîte de Petri (1000 ul / plat): se préparer pour la production pseudovirus SRAS Un tube Le tube B 2X HBS 500 ul 2,5 M CaCl 2 50 ul ADN plasmidique S SRAS-CoV 5 ug VIH-1 plasmide (pNL4-3.luc.RE) 5 ug Dih 2 O 500 ul Tableau 1. Préparation du mélange de transfection et les volumes Les volumes indiqués dans le tableau 1 sont pour une unité de transfection. Si plus des flacons ou des plats sont utilisés pour la transfection, ajuster les volumes en conséquence. Ajouter la solution d'ADN et de calcium dans le tube B dans le tube A dans un goutte à goutte, tout en maintenant constante et douce de mélange dans un tourbillon. Laissez reposer le mélange à la température ambiante pendant 20-30 min. La clé pour la transfection de phosphate de calcium succès dépend de la taille et la forme du précipité formé. Ainsi, le mélange doit être constamment vortexé et lentement pour répondre à cette exigence et, par conséquent, d'améliorer l'efficacité de la transfection. Ajouter le mélange goutte à goutte, et même dans les cellules 293T (4000 ul / flacon). Cellules en culture dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO 2. Remplacez le milieu de culture avec des produits frais sans sérum OPTI-MEM-je réduite Sérum Medium (50 ml / flacon) 8-10 h post-transfection. Continuer à cultiver des cellules pour deux jours de plus dans le même état. Recueillir le surnageant contenant la protéine exprimée rRBD 72 h post-transfection. Centrifuger à 6000 rpm pendant 15 min pour éliminer les débris cellulaires. Ajouter un cocktail inhibiteur de protéase pour le surnageant collecté et stocker à 4 ° C pendant la nuit. Le lendemain, purifier rRBD protéine recombinante à partir du surnageant de culture en utilisant les instructions du fabricant Superflow Ni-NTA suivante. Concentré protéine purifiée en utilisant des tubes ultra concentration Amicon -15. Après la concentration de protéines,Ajouter PBS à la concentration des tubes et centrifuger à nouveau pour enlever l'imidazole dans le tampon d'élution. Calculer la concentration de protéines et de stocker des protéines purifiées à -80 ° C jusqu'à utilisation. 2. Immunisation de souris et de prélèvement d'échantillons Préchauffer Sigma adjuvant System (SAS) à 40-45 ° C selon les instructions du fabricant. Ajouter 1 ml de PBS par flacon et bien mélanger. Préparer protéines adjuvant émulsion selon le protocole dans le tableau 2. Pipeter calculée protéines rRBD dans un tube de 1,5 ml. Ajouter un volume égal de SAS adjuvant dans le tube et vortexer vigoureusement pendant 2-3 min pour former l'émulsion. Astuce: Les volumes indiqués dans le tableau 2 sont pour une souris. Ajustez le volume en fonction du nombre de souris utilisées réelle. Pour chaque groupe, mélanger les protéines et de l'adjuvant nécessaire pour chaque vaccin. Toujours préparer un échantillon supplémentaire pour la vaccination pour assurer l'exactitude. Groupe 1 er vaccins (200 ul / souris) 2 ème vaccin (200 ul / souris) 3 ème vaccin (200 ul / souris) protéines rRBD 20 g de protéine dans du PBS (100 ul) + 100 uL SAS 10 g de protéine dans du PBS (100 ul) + 100 uL SAS 10 g de protéine dans du PBS (100 ul) + 100 uL SAS PBS de contrôle 100 ul de PBS + 100 uL SAS 100 ul de PBS + 100 uL SAS 100 ul de PBS + 100 uL SAS Tableau 2. Protocole d'immunisation de la souris Sous-cutanée en prime-vacciner les femmes souris Balb / c (4-6 semaines, 5 souris / groupe), et de stimuler deux fois avec rRBD et SAS comme indiqué au tableau 2. Utilisez PBS groupe comme le contrôle. Le site d'injections sous-cutanées généralement choisi est la peau lâche entre les omoplates. Alternativement, l'abdomen ventral est couramment utilisé, car il est plus facile à injecter, et peut observer des fuites provenant des sites d'injection. Lorsque des doses répétées de vaccins sont utilisés, il est facile de sélectionner des sites d'injection différents, empêchant le potentiel des réactions cutanées locales. Purger souris par rétro-orbitale avec anesthésie avant l'immunisation et 10 jours après chaque vaccination, et la chaleur des sérums à 56 ° C pendant 30 min pour inactiver le complément. Magasin de sérums de souris à -20 ° C jusqu'à utilisation. 3. Détection de neutralisation utilisant test de neutralisation pseudovirus Préparer pseudovirus SRAS Fractionner les cellules 293T en 100 mm plats de Pétri de culture tissulaire (2×10 6 cellules / boîte) 16 h avant la transfection, et cultiver des cellules comme ci-dessus. Préparer des réactifs de transfection, comme indiqué dans le tableau 1. Co-transfection un plasmide codant pour le SRAS-CoV protéine S et d'un plasmide codant pour Env-défectueux, la luciférase exprimant génome VIH-1 (pNL4-3.luc.RE) en utilisant le réactif de transfection de phosphate de calcium. Remplacer moyenne avec 10 ml DMEM frais contenant 10% de FBS et 1% P / S 8-10 h post-transfection. Recueillir le surnageant contenant pseudovirus SRAS 72 h post-transfection. Pseudovirus Filtrer à travers un filtre de 0,45 um. Aliquoter et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Dosage de SRAS neutralisation pseudovirus Fractionner les cellules 293T exprimant des récepteurs du SARS-CoV ACE2 (ACE2/293T) à 10 4 cellules/100 ul / puits de plaques de 96 puits de culture de tissus 16 h avant l'infection. Diluer pseudovirus SRAS en deux volets afin de détecter le titre du virus dans les cellules ACE2/293T. Série diluer sérums de souris dans les plaques de 96 puits de culture tissulaire, et ajouter un volume égal de pseudovirus SRAS titré. Préincuber les plaques à 37 ° C pendant 1 h. Après incubation, ajouter 100 ul du mélange de sérums-pseudovirus aux cellules ACE2/293T, et de continuer à cultiver des cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2. Ajouter DMEM frais 24 h plus tard. Supprimer complètement les surnageants de culture à partir des plaques de 72 h post-infection. Ajouter 1X réactif luciférase lyse cellulaire de la culture (60 ul / puits), et de promouvoir la lyse cellulaire avec agitation constante de plaques pendant 1-2 heures à température ambiante. Lysats de cellules de transfert (50 ul / puits) en plaques luminomètre (Microfluor plaques de 96 puits). Ajouter un substrat luciférase (50 ul / puits) inclus dans le système de dosage de la luciférase, et de détecter relativement activité luciférase dans les Ultra 384 luminomètre. Calculer titre SRAS neutralisation pseudovirus et présents sous le titre d'anticorps neutralisant 50% (NT 50) 6.