Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

1. Rekombinante SARS-CoV RBD Protein Preparation Bereiten Calciumphosphat Transfektionsreagenz 2X HBS-Puffer Zubereitung: Mischen Sie 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O und 13,0 g HEPES. Der pH-Wert auf 7,00 und bringen Gesamtvolumen von 1000 ml in destilliertem Wasser. Nach Filtrieren der Lösung für die Sterilisation, Aliquot und speichern Sie es bei -20 ° C. Hinweis: Jede Veränderung des pH-Wertes würde die Transfektion Ergebnisse beeinflussen. So ist es ratsam, mehrere pH-Werten um 7,00 (z. B. 6.99, 7.00, bzw. 7,01) Test und finden Sie das beste für die Transfektion mit der Methode eingeführt unten. 2,5 M CaCl 2 Vorbereitung: In 73,5 g CaCl 2 · 2H 2 O in destilliertem Wasser in einem Endvolumen von 200 mL. Filtern Sie die Lösung und bei -20 ° C. Das rekombinante Plasmid-Transfektion und Proteinreinigung Split 293T-Zellen bei 50-70% Konfluenz 24 h vor der Transfektion. Wachsen Zellen in T-175 cm 2 Zellkulturflaschen in 40 ml DMEM mit 10% Hitze-inaktiviertes (HALLO) FBS und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) bei 37 ° C in 5% CO 2. Alle Transfektionsreagenzien sollten auf Raumtemperatur gebracht werden, bevor der Transfektion. Diese Reagenzien sind 2X HBS, 2,5 M CaCl 2, DIH 2 O, und rRBD Plasmid 6. Hinweis: Die endgültige rekombinante Plasmid verwendet für die Proteinexpression ein Signalpeptid enthalten sollte, um die Sekretion des exprimierten rekombinanten Proteine ​​im Kulturüberstand gewährleisten zu konstruieren. A 6x His-Tag kann der C-Terminus des exprimierten Proteins für eine einfache Reinigung hinzugefügt werden. Bereiten Sie eine 50 ml (A) und 15 ml (B) BD Falcon-Röhrchen, und fügen Sie Reagenzien, die Rohre, wie in Tabelle 1 angegeben. Hinzufügen weiterer 2X HBS Puffer Rohr A. In Rohr B, fügen 2.5M CaCl 2 und rRBD Plasmid, und bringen Sie die Lautstärke auf den Bedarf in DIH 2 O. A. Ein T-175 cm 2 Zellkulturflasche (4000 ul / Kolben): Vorbereitung auf rRBD Ausdruck Rohr A Rohr B 2X HBS 2000 ul 2.5M CaCl 2 200 ul rRBD Plasmid-DNA 40 ug DIH 2 O zu 2000 ul B. Ein 100-mm-Petrischale (1000 ul / Schale): Vorbereitung auf SARS pseudovirus Produktion Rohr A Rohr B 2X HBS 500 ul 2.5M CaCl 2 50 ul SARS-CoV S Plasmid-DNA 5 ug HIV-1-Plasmid (pNL4-3.luc.RE) 5 ug DIH 2 O zu 500 ul Tabelle 1. Transfektion Gemischaufbereitung und Volumina Die Volumina in Tabelle 1 aufgelistet sind für eine Transfektion Einheit. Wenn mehr Flaschen oder Geschirr für die Transfektion eingesetzt werden, stellen Sie Volumen entsprechend. Fügen Sie die DNA-Calcium-Lösung in Rohr B in das Rohr A in einem tropfenweise Weise, während eine konstante und schonende Durchmischung in einen Strudel. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur stehen lassen für 20-30 min. Der Schlüssel für eine erfolgreiche Calciumphosphat-Transfektion hängt von der Größe und Form der Niederschlag gebildet. So sollte die Mischung kontinuierlich und langsam verwirbelt werden, um diese Anforderung zu erfüllen und, als Folge, zu verbessern Transfektion Wirksamkeit. Add-Gemisch in einer tropfenweise und sogar Weise in 293T-Zellen (4000 ul / Kolben). Kultur-Zellen im Brutschrank bei 37 ° C in 5% CO 2. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischem serumfreien OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium (50 ml / Flasche) 8-10 h nach der Transfektion. Weiter zur Kultivierung von Zellen für zwei Tage in dem gleichen Zustand. Sammeln enthaltende Überstand ausgedrückt rRBD Protein 72 h nach der Transfektion. Zentrifugation bei 6000 rpm für 15 min, um Zelltrümmer zu entfernen. Add-Protease-Inhibitor-Cocktail, um die gesammelten Überstand und lagern bei 4 ° C über Nacht. Am nächsten Tag, zu reinigen rRBD rekombinanten Proteins aus dem Kulturüberstand mittels Ni-NTA Superflow folgenden Anweisungen des Herstellers. Konzentrieren Sie sich gereinigtes Protein mit Amicon Ultra -15 Konzentration Röhren. Nach Proteinkonzentration,add PBS, um die Konzentration-und Zentrifugenröhrchen wieder Imidazol in Elutionspuffer zu entfernen. Berechnen Proteinkonzentration und speichern gereinigtes Protein bei -80 ° C bis zur Verwendung. 2. Maus Immunisierung und Probennahme Pre-warm Sigma Adjuvans-System (SAS) auf 40-45 ° C nach den Anweisungen des Herstellers. 1 ml PBS pro Fläschchen geben und gut mischen. Bereiten Protein-Adjuvans-Emulsion nach dem Protokoll in Tabelle 2. Pipette berechnet rRBD Protein in ein 1,5 ml-Röhrchen. Add gleichen Volumen SAS adjuvant mit dem Rohr und kräftig vortexen für 2-3 min, um Emulsion zu bilden. Hinweis: Die Volumina in Tabelle 2 aufgelistet sind für eine Maus. Lautstärkeanpassung entsprechend der tatsächlichen Maus Zahlen verwendet. Für jede Gruppe, mischen die Proteine ​​und Adjuvans für jeden Impfstoff erforderlich. Immer bereiten eine zusätzliche Probe für die Impfung, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Gruppe 1 M. Impfstoff (200 ul / Maus) 2. Impfung (200 ul / Maus) 3 rd-Impfstoff (200 ul / Maus) rRBD Protein 20 ug Protein in PBS (100 ul) + 100 ul SAS 10 ug Protein in PBS (100 ul) + 100 ul SAS 10 ug Protein in PBS (100 ul) + 100 ul SAS PBS-Kontrolle 100 ul PBS + 100 ul SAS 100 ul PBS + 100 ul SAS 100 ul PBS + 100 ul SAS Tabelle 2. Maus Immunisierungsprotokoll Subkutan prime-Immunisierung weibliche BALB / c-Mäuse (4-6 Wochen alt, 5 Mäuse / Gruppe), und steigern Sie zweimal mit rRBD und SAS als in Tabelle 2 angegebenen. Verwenden Sie PBS-Gruppe als Kontrolle. Der Standort für die subkutane Injektionen in der Regel gewählt wird, die lose Haut zwischen den Schulterblättern. Alternativ ist der ventralen Bauch häufig verwendet, weil es einfacher ist zu injizieren, und kann jede Leckage aus der Injektionsstelle zu beobachten. Bei der wiederholten Dosen von Impfstoffen verwendet werden, ist es einfach, verschiedene Injektionsstellen wählen, verhindern, dass potenzielle lokale Hautreaktionen. Bleed Mäusen über retroorbitalen mit Betäubung vor der Immunisierung und 10 Tagen nach jeder Impfung und Wärme Seren bei 56 ° C für 30 min auf Komplement zu inaktivieren. Shop Mausseren bei -20 ° C bis zur Verwendung. 3. Neutralisation Erkennung anhand Pseudovirus Neutralisationstest Bereiten SARS pseudovirus Split 293T-Zellen in 100 mm Gewebekultur-Petrischalen (2×10 6 Zellen / Schale) 16 h vor der Transfektion und wachsen Zellen wie oben beschrieben. Bereiten Transfektionsreagenzien wie in Tabelle 1 angegeben. Co-Transfektion ein Plasmid kodiert SARS-CoV S-Protein und ein Plasmid kodiert Env-defekt, Luciferase-exprimierende HIV-1-Genoms (pNL4-3.luc.RE) mit Calciumphosphat Transfektionsreagenz. Ersetzen-Medium mit 10 ml frischem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S 8-10 h nach der Transfektion. Sammeln enthaltende Überstand SARS pseudovirus 72 h nach der Transfektion. Filter pseudovirus durch ein 0,45 um-Filter. Aliquotieren und bei -80 ° C bis zur Verwendung. SARS pseudovirus Neutralisationstest Split 293T-Zellen, die SARS-CoV-Rezeptor ACE2 (ACE2/293T) bei 10 4 Zellen/100 ul / well in 96-well-Zellkulturplatten 16 h vor der Infektion. Verdünnen SARS pseudovirus durch 2-fach auf die Virustiter in ACE2/293T Zellen zu erkennen. Serienmäßig verdünnen Mausseren in 96-well-Zellkulturplatten, und fügen Sie gleichen Volumen titriert SARS pseudovirus. Vorinkubieren die Platten bei 37 ° C für 1 h. Nach der Inkubation mit 100 ul der sera-pseudovirus Mischung ACE2/293T Zellen und weiterhin Zellen bei 37 ° C wachsen in 5% CO 2. Fügen Sie frisches DMEM 24 h später. Vollständig zu entfernen Kulturüberständen von den Platten 72 h nach der Infektion. Add 1X Luciferase Zellkultur Lysereagens (60 ul / well) und die Förderung der Zelllyse unter ständigem Schütteln der Platten für 1-2 h bei Raumtemperatur. Transfer-Zelllysaten (50 ul / well) in Luminometer Platten (Microfluor 96-Well-Platten). Add Luciferase Substrat (50 ul / well) in Luciferase-Assay-Systems, sowie erkennen relativen Luciferaseaktivität in Ultra 384 Luminometer. Berechnen SARS pseudovirus Neutralisation Titer und Gegenwart als 50% der Patienten neutralisierende Antikörper-Titer (NT 50) 6.