Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas
Summary
Este protocolo describe la disección en vivo de<em> Drosophila</em> Larvas con el propósito de la imagen del movimiento de las buenas prácticas agrarias etiquetados vesículas axonal en rieles de microtúbulos.
Abstract
Elucidar los mecanismos de transporte axonal ha demostrado ser muy importante para determinar cómo los defectos en el transporte de larga distancia afecta a diferentes enfermedades neurológicas. Los defectos en este proceso esencial puede tener efectos perjudiciales en el funcionamiento neuronal y el desarrollo. Hemos desarrollado un protocolo de disección que está diseñado para exponer los<em> Drosophila</em> Nervios larvas segmentaria para ver el transporte axonal en tiempo real. Hemos adaptado este protocolo para obtener imágenes en vivo desde el publicado por Hurd y Saxton (1996) utiliza para immunolocalizatin de las larvas de los nervios segmentarios. Disección cuidadosa y condiciones adecuadas de amortiguación son críticos para maximizar la vida útil de las larvas disecadas. Cuando se hace correctamente, las larvas disecados han demostrado el transporte de vesículas robusta durante 2-3 horas en condiciones fisiológicas. Usamos el método de UAS-GAL4<sup> 1</sup> Para expresar GFP-etiquetados APP o vesículas sinaptotagmina dentro de un solo axón o axones muchos nervios en las larvas segmentaria mediante el uso de diferentes neuronal GAL4 conductores. Otros marcadores marcados con fluorescencia, por ejemplo, mitocondrias (MitoTracker) o lisosomas (LysoTracker), puede aplicarse también a las larvas antes de ver. GFP-vesícula movimiento y el movimiento de partículas se pueden ver simultáneamente con longitudes de onda diferentes.
Protocol
Discussion
Imágenes in vivo de transporte de vesículas sinápticas en Drosophila nervios larvas segmentaria es una poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos en el transporte axonal. Hemos utilizado anteriormente este protocolo para evaluar la dinámica de transporte dentro de los nervios larvas expresar ampliado repite polyQ para dilucidar cómo la expansión de repeticiones afectan a la dinámica del transporte de vesículas 3. El uso de este protocolo la velocidad de movimient…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SG es apoyado por fondos de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo y de John R. Oishei Fundación.
MK fue apoyado por un Premio de Investigación de Estudiantes de la UB por curca.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Scientific | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | ||
| 2 Pair Forceps | Fischer Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | ||
| Box of Dissection Pins | Fine Scientific | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
