Visualización de la replicación del ADN mitocondrial en las células individuales de amplificación de la señal Edu

1. Preparación de las neuronas Ganglio de la raíz dorsal (DRG), las neuronas se cultivan en estéril (autoclave) 12 mm cubreobjetos de vidrio en una placa de cultivo de 24 pocillos. El stock de 10 mM de Educación (en DMSO, clic en él Edu microplacas Kit de ensayo) es normalmente diluido 1:100 en medio de cultivo para hacer una solución de Edu 10X (100 mM) y luego se diluyó 1:10 en la cultura de los pozos (por ejemplo, 30 l de la solución de Edu 10 veces en un total de 300 L de medio de cultivo). DRG neuronas se incubaron con una concentración final de Edu M 10 a 37 ° C y 5% de CO 2 entre 2-24 horas. La cantidad de tiempo depende de cómo los tratamientos afectan a la velocidad de síntesis de ADN mitocondrial. En una campana de extracción, las neuronas DRG se fijan en paraformaldehído al 2% durante 10-15 minutos a temperatura ambiente, se lavan dos veces en PBS 1X 2-5 minutos de cada lavado y almacenado en PBS 1X durante un máximo de 1 mes a 4 ° C. Cubreobjetos se transfieren con pinzas de punta fina a una cámara húmeda preparada (plato Corning BioAssay con fondo negro empapelado para el contraste, envuelto en papel de aluminio para proteger los componentes sensibles a la luz y humedecido con agua saturada Kimwipes) y se coloca en una lámina de Parafilm M que proporciona una superficie hidrofóbica para confinar las soluciones a los cubreobjetos. El protocolo a continuación está diseñado para 28 cubreobjetos y las soluciones se preparan para el 32 cubreobjetos (alrededor del 14% del volumen extra). Soluciones con componentes caros o limitados se hacen para que l 75-80 se utilizan en cada portaobjetos. De lo contrario, 200-300 l se utilizan para las soluciones de lavado y el bloque que se laven las soluciones anteriores. Vuelva a aplicar 1X PBS para cubrir la superficie de cada cubreobjetos (200-300 l). Preparar el ensayo clic en él y tyramide kits amplificación de la señal como se describe a continuación y en las instrucciones del fabricante. Preparación de clic en él Edu Kit de ensayo de microplacas La mayoría de los componentes del Kit clic en él Edu Microplacas vienen pre-hechos y se almacenan a 4 ° C [2x clic en él tampón de reacción (componente E 10x), CuSO4 (100 mM, componente F), clic en él Edu fijador ( Buffer componente D) y bloqueo (2x componente H)]. Clic en él aditivo Buffer Edu (10x componente G) se almacenan a -20 ° C para evitar que se vuelvan de color amarillo-marrón con el tiempo. Este componente tolera repetidos ciclos de congelación y descongelación. El Oregon Green 488 azida (componente B) se debe dividir en pequeñas alícuotas (10-20 l) para reducir al mínimo los ciclos de congelación-descongelación y se almacenan a -20 ° C. Para preparar una solución madre de la anti-Oregon conjugado HRP Verde (Componente I), añadir 75 l de agua Milli Q dH 2 O en el vial. Mezclar por pipeteo suave o dándole la vuelta para evitar la formación de espuma y se almacenan a 4 ° C. No vórtice. Preparación de la TSA Kit # 12, con HRP de cabra anti-IgG de conejo y Alexa Fluor 488 Kit tiramida Para preparar la solución madre tyramide, disolver el material sólido (Alexa Fluor 488 tyramide, Componente A) en 150 l de DMSO (Componente B). Invertir el frasco varias veces para disolver cualquier recubrimiento tyramide los lados del vial. Solución de tienda de valores en pequeñas alícuotas (10-20 l) a ≤ -20 ° C, desecado y protegido de la luz. 2. Clic en ella 5-etinil-2-desoxiuridina (EDU) de etiquetado NOTA: Todas las soluciones se eliminan con una pipeta de transferencia bombilla con una punta de 200 l fijado hasta el final para eliminar suavemente las células de los líquidos sin perder. Evite el uso de una línea de vacío, que suele quitar las soluciones con demasiada fuerza. Una pipeta de bulbo se utiliza para inundar suavemente cubreobjetos con 200-300 L de las soluciones de lavado para lavar a fondo con la solución anterior. Las células se permeabilized con 0,1% Triton X-100-1X en la solución de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente en una cámara cubierta húmeda. Destinar el 1% Triton-X-100 soluciones madre. Hacer 3.000 l de 0,1% Tritón-X-100 mediante la adición de 300 L 1% Tritón-X-100 en stock para 2700μL 1X PBS. Use 75-80 L por tapar. Retire el Triton X-100 solución y enjuagar dos veces con PBS 1X. La actividad peroxidasa endógena se apaga por un 1% H 2 O 2 en la solución 1X PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diluir 30% de H 2 O 2 con solución PBS 1X. Esta solución debe ser fresca, pero se puede hacer durante el paso de permeabilización de 10 minutos por encima de (paso 3.1). Hacer 3.000 l de un 1% H 2 O 2 mediante la adición de 100 l 30% de H 2 O 2 hasta 2900 l de PBS 1X. Use 75-80 L por tapar. Eliminar la solución de peroxidasa y enjuague dos veces con PBS 1X. Clic en él Edu reacción El 32 cubreobjetos (32 x 80 = l2.560 l) de un total de 2.560 l es necesario. La reacción se realiza 2 veces en el año 1280 l, que es la mitad del volumen total de la reacción. Recién preparar el cóctel de reacción clic en él antes de iniciar la solución después de 5 minutos (paso 3.5). Mezcla el cóctel pipeteando arriba y hacia abajo. No vórtice al hacer esta reacción. 2 x cóctel de reacción Los componentes son de clic en él Edu Kit de ensayo de microplacas La mitad del volumen: 1.280 l Milli Q dH 2 O 1132,8 l 2x clic en él tampón de reacción (componente E 10x) 100,3 l Clic en él Edu aditivo Buffer (G componente 10 veces) 25,6 l CuSO 4 (100 mm, F de componentes) 25,6 l Oregon Green azida (un componente) 6,4 l Total 1290,7 l NOTA: Los volúmenes utilizados por encima son proporcionales a los volúmenes que figuran en las direcciones que Click-Edu kit de ensayo de microplacas. El volumen final del cóctel de reacción es un poco más de 1.280 mL. El clic en él 2X de reacción se diluyó con igual volumen de clic en él Edu fijador (componente D) justo antes de su uso. Mezclar estas dos hace una solución de reacción uniforme para todos los cubreobjetos. Añadir 1290,7 l clic en él Edu fijador (componente D) para el cóctel de reacción 1290,7 mL. Use 75-80 L por tapar. Después de arreglar las neuronas con clic en él Edu fijador (componente D) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Eliminar revisión y añadir cóctel de reacción a la anterior (paso 3.4). Cubierta para proteger de la luz y se incuba durante 25 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el cóctel de reacción. Lavar dos veces con Buffer diluido 1X bloqueo (2X componente H). Hacer 5.200 l de 1X tampón de bloqueo mediante la dilución de 2.600 l de búfer de bloqueo (2x componente H) con un volumen igual de MilliQ d H 2 O (2600 l). Use 75-80 L por tapar. Bajo un microscopio epi-fluorescente, revise Oregon manchas verdes en los núcleos de las células de control de actividad mitótica. 3. Tiramida amplificación de la señal (TSA) de Educación de señal Agregar solución al 1% a cada bloque de TSA cubreobjetos y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Hacer l 6000 de la solución de bloqueo del 1% TSA pesando 0,06 g de reactivo de bloqueo de la TSA (TSA # 12 kit, componente D) y agregarlo a 6.000 l de PBS 1X. Vortex para mezclar. Además de suero de cabra al 5% en la solución de bloqueo del 1% de TSA a menudo ayuda a reducir la unión no específica. En pocas palabras girar la anti-Oregon Green acciones peroxidasa conjugado (Componente I del ensayo clic en él Edu microplacas), preparado 2-24 horas antes de la TSA. Diluir el anticuerpo primario 1:300 en solución al 1% e invertir el bloqueo de la TSA o una pipeta hacia arriba y abajo suavemente para mezclar. No vórtice a fin de no perturbar el anticuerpo conjugado con HRP. Quitar el 1% solución bloque TSA, añadir 75 l de cada cubreobjetos y se incuba durante la noche a 4 ° C. El anticuerpo se puede utilizar más concentrado, como 1:150, pero que se suministra en cantidades limitadas, por lo que utilizar con moderación. Una vez más, la adición de suero de cabra al 5% en la solución de bloqueo del 1% de TSA a menudo ayuda a reducir la unión no específica del anticuerpo anti-Oregon Green peroxidasa de rábano conjugada. Hacer 2.560 l de una solución de anticuerpos 1:300 añadiendo 8,53 l del conejo acciones anti-Oregon Green-HRP (Click-iT Edu microplacas de ensayo) a 2560 l 1% de bloqueo de la TSA. Mezclar por pipeteo suave o inversión. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y enjuáguese la boca tres veces con PBS 1X. Incubar los cubreobjetos en el lavado final por otros 30-60 minutos a temperatura ambiente para asegurar que el anticuerpo no fijado principal sea removida. Prepare reacción tiramida de 2560 l (32 x 80 cubreobjetos l). Hacer 400 l de un 0,15% de H 2 O 2 solución (100X) mediante la adición de 2 l de 30% H 2 O 2 (TSA kit n. º 12, de componente F) a 398 l tampón de amplificación (TSA # 12 kit, componente E) . Esto debe hacerse justo antes de que sea necesario. Para un volumen final de 2560 l se combinan: 25.6 tiramida-488 l (TSA Juego de componentes A) 2.508,8 Buffer amplificación l (TSA E Juego de componentes) 25,6 l 0,15% de H 2 O 2 (de arriba para una final de 0,0015% H 2 O 2) Quitar 1X PBS e incubar la reacción tiramida durante 15 minutos a temperatura ambiente. Quitar reacción tiramida y enjuague tres veces con PBS 1X, la incubación en el lavado final por 30-60 minutos a temperatura ambiente, como antes. Compruebe que el etiquetado del ADNmt en un microscopio epi-fluorescente. Cubreobjetos se montan en portaobjetos de vidrio con un medio Antifade de montaje, tales como prolongar oro con DAPI. Por otra parte, el etiquetado de Educación y la amplificación puede ser seguido por inmunocitoquímica fluorescentes estándar para etiquetar otros marcadores celulares. 4. Los resultados representativos: Visualización de la replicación del ADN mitocondrial como marcador de la biogénesis mitocondrial Estamos interesados ​​en cómo las neuronas sensoriales (Figura 1) regular el número de mitocondrias. Este protocolo etiqueta nueva síntesis de ADN mitocondrial con un marcador fluorescente como una forma de medir la producción de nuevas mitocondrias. La incorporación de la Educación sintética de nucleótidos seguido de la química haga clic en la amplificación de Oregon Green-azida y posterior con el Alexa-Fluor 488 resultados tyramide en el etiquetado de ADN mitocondrial con una señal verde fluorescente (Figura 2). Si se hace correctamente, la señal amplificada verde es lo suficientemente mayor que la fluorescencia de fondo (como la autofluorescencia celular o un efecto secundario de la reacción de HRP-TSA). Esta técnica está diseñada para etiquetar ADNmt recién replicado con el fin de visualizar y cuantificar la biogénesis mitocondrial dentro de los compartimentos subcelulares de las neuronas (Figura 3). El etiquetado permite a Edu para inmunocitoquímica fluorescentes con posterioridad a la etiqueta de otros marcadores celulares como neurofilamentos (Figura 3D). La reacción de la TSA también se puede hacer con otras fluorescentes tyramides Alexa Fluor como Alexa Fluor 594-tyramide. Esto se traduce en una señal fluorescente verde de la reacción nuclear clic Oregon Green-azida en el núcleo, pero no hay ninguna señal verde en el ADNmt, que no se puede detectar antes de la TSA. La amplificación con Alexa Fluor 594-tyramide intensifica la etiqueta nuclear y pone de manifiesto la Educación incorpora en el ADNmt, con una señal roja fluorescente (Figura 4). Un procedimiento de amplificación similar se utiliza para visualizar la incorporación de BrdU en nueva síntesis mitocondrial (Figura 5), ​​sin embargo, este método requiere un paso adicional para recuperar el epítopo BrdU por un ácido fuertes (HCl) o digestión enzimática, lo que no es necesario para Edu etiquetado. Figura 1. Representante de contraste de interferencia diferencial (DIC) de las imágenes de embriones (izquierda) y adulto (derecha) ganglio de la raíz dorsal (GRD) neuronas que se utilizan normalmente para su análisis. Bares = 10 micras. Figura 2. Diagrama esquemático que representa el procedimiento para el etiquetado de Edu en el ADN mitocondrial con una señal verde fluorescente. El esquema representa el protocolo de tres pasos para el etiquetado de Edu en el ADN mitocondrial con una señal verde fluorescente. Actividad mitótica F11 células de neuroblastoma servir como un control positivo y muestran el patrón de etiquetado de Edu, que fue incorporado en el ADN nuclear y mitocondrial. El primer paso (P1) es la incorporación de un análogo de la timidina en el ADN mitocondrial de nueva síntesis mediante la incubación de las células en presencia de Edu. El segundo paso (P2) se basa en la química haga clic en la etiqueta Edu incorporado con una Oregon Green-azida. Señal verde es visible en los núcleos de las células que replican su ADN nuclear. El paso final (P3) es amplificar la Gr Oregoneen-azida señal de incubación con un anticuerpo de conejo conjugado HRP-en contra de Oregon Green seguido de incubación con Alexa Fluor 488 tyramide etiquetado de la presencia de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para visualizar la señal verde en el ADNmt. Figura 3. Edu etiquetado de ADN mitocondrial en el ganglio de la raíz dorsal (GRD) neuronas. Las neuronas se incubaron con Edu y la señal es posteriormente amplificada para revelar el ADNmt que incorpora Edu. Representante imágenes de fluorescencia superpuestos en la luz transmitida muestra señales de color verde punteada de amplificación Edu (Edu-OG-TSA, verde) incorporada en el ADNmt de nueva síntesis de los dos embriones (A) y adultos (BD), las neuronas DRG. El procedimiento de etiquetado Edu permite posterior tinción de inmunofluorescencia de marcadores neuronales como neurofilamentos (D, αNF, en rojo). Las barras de escala = 10 micras. Figura 4. Diagrama esquemático que representa el procedimiento para el etiquetado de Edu en el ADN mitocondrial con una señal fluorescente de color rojo. El esquema representa el protocolo de tres pasos para el etiquetado de Edu en el ADN mitocondrial con una señal fluorescente de color rojo. Actividad mitótica F11 células de neuroblastoma servir como un control positivo y muestran el patrón de etiquetado de Edu, que fue incorporado en el ADN nuclear y mitocondrial. El primer paso (P1) es la incorporación de un análogo de la timidina en el ADN mitocondrial de nueva síntesis mediante la incubación de las células en presencia de Edu. El segundo paso (P2) se basa en la química haga clic en la etiqueta Edu incorporado con una Oregon Green-azida. Señal verde es visible en los núcleos de las células que replican su ADN nuclear. El paso final (P3) es amplificar la Oregon Green-azida señal de incubación con un anticuerpo de conejo conjugado HRP-en contra de Oregon Green seguido de incubación con Alexa Fluor 594 tyramide etiquetado de la presencia de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para visualizar rojo de la señal en el ADNmt. Figura 5. BrdU y amplificación de la señal tyramide con una señal fluorescente de color verde o rojo en el ADNmt. El diagrama representa el procedimiento para el etiquetado de BrdU en el ADNmt de nueva síntesis, ya sea con una señal fluorescente de color verde o rojo. Un primer paso es necesario para recuperar el epítopo BrdU por un ácido (HCl) o digestión enzimática, lo que no es necesario para el etiquetado de Edu. El siguiente paso es incubar con un ratón primaria de anticuerpos anti-BrdU. Esto es seguido por incubación con peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado de cabra anti-ratón. Finalmente, la señal se amplifica con un tyramide verde o rojo marcado con fluorescencia en presencia de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para visualizar la señal en el ADNmt.