Visualisatie van mitochondriaal DNA-replicatie in afzonderlijke cellen door Edu signaalversterking
Summary
We ontwikkelden een gevoelige techniek om nieuw gesynthetiseerde mitochondriaal DNA (mtDNA) label in individuele cellen om mtDNA biogenese studeren. De techniek combineert de integratie van onderwijs, samen met een tyramide signaalversterking (TSA) protocol om mtDNA replicatie te visualiseren in subcellulaire compartimenten van neuronen.
Abstract
Mitochondriën zijn de belangrijkste regulatoren van de cellulaire energie en mitochondriale biogenese is een essentieel onderdeel van de regulering van mitochondria aantallen in gezonde cellen 1-3. Een benadering voor de bewaking mitochondriale biogenese is het meten van de snelheid van mitochondriaal DNA (mtDNA) replicatie 4. We ontwikkelden een gevoelige techniek om nieuw gesynthetiseerde mtDNA in afzonderlijke cellen het etiket om te mtDNA biogenese studeren. De techniek combineert de inbouw van 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) 5-7 met een tyramide signaalversterking (TSA) 8 protocol om mtDNA replicatie te visualiseren in subcellulaire compartimenten van neuronen. EDU is superieur aan andere thymidine-analogen, zoals 5-broom-2-deoxyuridine (BrdU), omdat de eerste klik reactie op het label Edu 5-7 niet vereist dat de harde zuur behandelingen of enzym verteert die nodig zijn voor het blootstellen van de BrdU epitoop . De mildere etikettering van Edu maakt directe vergelijking van de oprichting met andere cellulaire markers 9-10. De mogelijkheid om te visualiseren en te kwantificeren mtDNA biogenese biedt een essentieel instrument voor het onderzoeken van de mechanismen die gebruikt worden om mitochondriale biogenese reguleren en zou inzicht geven in de pathogenese geassocieerd met drugs toxiciteit, veroudering, kanker en neurodegeneratieve ziekten. Onze techniek is van toepassing op sensorische neuronen en andere celtypen. Het gebruik van deze techniek om mtDNA biogenese maatregel belangrijke implicaties in het bevorderen van het begrip van zowel de normale cellulaire fysiologie evenals bijzondere waardevermindering ziekte staten.
Protocol
Discussion
We ontwikkelden een gevoelige test om nieuw gesynthetiseerde mtDNA in individuele cellen met behulp van een tyramide signaalversterking van Edu label. Een van de grootste problemen tijdens de optimalisatie van dit protocol is de inconsistente resultaten tussen dekglaasjes. Wijzigingen zijn aangebracht in de Invitrogen kit protocollen om te voorkomen dat het mengen van kleine volumes op individuele coverslips en het maken van meester-oplossingen te gebruiken voor alle dekglaasjes. De 75-80 pi gebruikt voor elke 12 mm ronde glazen dekglaasje is een ideale volume volledig te bedekken van het oppervlak en biedt voldoende oplossing om consistente resultaten tussen monsters te geven. Incubatie tijden en reagens concentraties werden geoptimaliseerd, maar verbeteringen kunnen worden gezien met aanpassingen aan hen.
Het protocol is ontwikkeld om elk proces eenmaal uit te voeren. Er zijn echter enkele van de stappen zijn herhaald met nieuwe oplossingen voor monsters die niet na de eerste poging herstellen. In het bijzonder hebben de EDU klikken reactie stappen (3,4 tot 3,6) is herhaald zonder een significante toename in de achtergrond fluorescentie. De anti-Oregon Green-HRP antilichaam incubatie (4,1 tot 4.3) en de tyramide amplificatie (4.4-4.5) stappen zijn ook herhaald, maar resulteert vaak in een slechte signaal-ruisverhouding als gevolg van de verhoogde achtergrond fluorescentie.
De meest gevoelige reagentia zijn de Click-iT EDU Buffer Additief (Component G) en het konijn anti-Oregon Green-HRP antilichaam (afdeling I) van de Click-iT Edu Microplate Assay kit. De Click-iT Edu Buffer Additief draait geleidelijk aan geel na verloop van tijd indien bewaard bij 4 ° C en tussen de 6-12 maanden donkerder aanzienlijk. Opslag van de Click-iT Edu Buffer Additief bij -20 ° C zal verlichten deze kwestie. De etikettering en de tyramide versterking stappen werken het best als het konijn anti-Oregon Green-HRP antilichaam wordt gebruikt binnen 4-6 maanden voor de reconstructie van het in MilliQ dH 2 O.
De milde etikettering van onderwijs in mtDNA zorgt voor directe vergelijkingen met extra cellulaire merkers 9-11 en verbetert het nut van deze techniek ten opzichte van andere thymidine-analogen, zoals 5-broom-2-deoxyuridine (BrdU), die vereist dat een ruwe behandeling te herstellen zijn epitoop binnen DNA. Ons laboratorium 11-12 en 13-15 hebben anderen met succes gebruikt om BrdU mtDNA label. De BrdU etikettering techniek is vergelijkbaar met die gebruikt voor Edu, maar heeft een aantal belangrijke verschillen (figuur 5). Na de permeabilisatie stap hierboven genoemde (3.1 tot 3,2), is de BrdU epitoop hersteld met een denaturatiestap (2 N HCl gedurende 30 minuten bij 37 ° C gevolgd door drie wasbeurten in 1X PBS). De BrdU wordt dan gelabeld met een primair antilichaam tegen BrdU (Vector Laboratories verdund 1:50 in 1% oplossing van het blokkeren van de TSA kit en 's nachts geïncubeerd bij 4 ° C). Een secundaire antilichaam stap is nodig om de BrdU signaal (geit anti-muis IgG geconjugeerd aan HRP van de TSA kits # 2 en # 5, verdund 1:100 in 1% blockingbuffer en geïncubeerd gedurende 45 min bij kamertemperatuur) te versterken voorafgaand aan de de TSA stappen (+4,3 tot 4,5 boven). Met twee thymidine-analogen, Edu en BrdU, een label mtDNA is voordelig voor het uitvoeren van dubbele label experimenten waarbij mtDNA sequentieel kan worden geëtiketteerd pulse-labeling paradigma 11.
Ons laboratorium is met behulp van de EDU en BrdU de etikettering van mtDNA om de regeling van mitochondriale biogenese in de context van diabetische neuropathie, een veel voorkomende complicatie van diabetes te onderzoeken. We hebben met succes gebruikt de signaalversterking om veranderingen in mtDNA biogenese in individuele neuronen 11-12 te meten. Deze techniek zal nuttig zijn in andere experimenten ontworpen om de mechanismen van mtDNA replicatie en omzet of voor het identificeren van geneesmiddelen die mtDNA synthese remmen te verkennen. Daarnaast kunnen de basisprincipes van het versterken van Edu en BrdU signalen worden toegepast op andere studies die maatregel DNA-replicatie of reparatie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Subsidies NS-38849 en de DK-076160, de Juvenile Diabetes Research Foundation Centrum voor de Studie van complicaties bij diabetes, het Programma voor Neurologie onderzoek en ontdekking en de A. Alfred Taubman Medical Research Institute aan de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikte de morfologie en Image Analysis Kern van het Michigan Diabetes Research en Training Center, gefinancierd door National Institutes of Health Grant 5P60 DK-20572 van het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en nierziekten. De auteurs danken Scott T. Clarke van Molecular Probes / Invitrogen voor zijn waardevolle adviezen over de verschillende Click-iT Edu labeling kits en de gulle donatie van de reagentia voor de initiële ontwikkeling van het Edu amplificatietechniek ondersteunen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 12 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-82 | ||
| 245 mm x 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | ||
| Parafilm M | Fisher Scientific | PM-996 | ||
| paraformaldehye | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8532 | ||
| Phosphate buffered saline 10X solution | Fisher Scientific | BP399 | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-7M | ||
| Hydrogen peroxide, 30% in water | Fisher Scientific | BP2633 | ||
| Click-iT EdU Microplate Assay Kit | Invitrogen | C10214 | ||
| TSA Kit #12, with HRP—goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20922 | ||
| TSA Kit #15, with HRP–goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20925 | ||
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | ||
| Polyclonal rabbit Neurofilament antibody | Chemicon | AB1981 | ||
| Mouse monoclonal anti-BrdU antibody | Vector Laboratories | VP-B209 | ||
| TSA Kit #2, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20912 | ||
| TSA Kit #5, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20915 |
References
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).
- Dimmer, K. S., Scorrano, L. (De)constructing mitochondria: what for. Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).
- Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
- Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2′-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations. J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).
- Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels. J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, 626-636 (2008).
- Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In. Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).
- Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells. Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).
- Amiri, M., Hollenbeck, P. J. Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons. Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).
