تصور المتماثل الحمض النووي في خلايا فردية عن طريق تضخيم الإشارات EDU
Summary
طورنا تقنية حساسة لتسمية الحمض النووي توليف حديثا (و mtDNA) في الخلايا الفردية ، من أجل دراسة و mtDNA نشوء حيوي. أسلوب يجمع بين إدماج ايدو مع بروتوكول إشارة tyramide (TSA) التضخيم لتصور و mtDNA تكرارها داخل المقصورات التحت خلوية من الخلايا العصبية.
Abstract
الميتوكوندريا هي المنظمين الرئيسيين للطاقة الخلوية ونشوء حيوي الميتوكوندريا هي عنصر أساسي من عناصر تنظيم أعداد الميتوكوندريا في الخلايا السليمة 1-3. نهج واحد لرصد نشوء حيوي الميتوكوندريا هو قياس معدل الحمض النووي (و mtDNA) تكرار 4. طورنا تقنية حساسة للتسمية و mtDNA تصنيعه حديثا في الخلايا الفردية ، من أجل دراسة و mtDNA نشوء حيوي. أسلوب يجمع بين إدماج – 5 – إيثينيل 2' – deoxyuridine (ايدو) 5-7 مع تضخيم إشارة tyramide (TSA) 8 و mtDNA بروتوكول لتصور تكرارها داخل المقصورات التحت خلوية من الخلايا العصبية. EDU متفوقة على النظير ثيميدين أخرى ، مثل 5 برومو deoxyuridine – 2 (BrdU) ، لأن رد الفعل الأولي لايدو فوق التسمية 5-7 لا تتطلب علاجات حمض القاسية أو هضم أنزيم التي مطلوبة من أجل فضح حاتمة BrdU . وأكثر اعتدالا توسيم ايدو يسمح للمقارنة مباشرة لتأسيسها مع علامات الخلوية الأخرى 9-10. القدرة على تصور وتحديد نشوء حيوي و mtDNA يوفر أداة أساسية عن التحقيق في الآليات المستخدمة لتنظيم نشوء حيوي الميتوكوندريا وستوفر نظرة ثاقبة على المرضية المرتبطة سمية الدواء ، والشيخوخة والسرطان وأمراض الاعصاب. أسلوبنا ينطبق على الخلايا العصبية الحسية ، وكذلك أنواع الخلايا الأخرى. استخدام هذه التقنية لقياس و mtDNA نشوء حيوي لها انعكاسات كبيرة في تعزيز فهم الفيزيولوجيا الخلوية العادية وكذلك الحالات المرضية غير جيدة.
Protocol
Discussion
طورنا مقايسة الحساسة لتسمية و mtDNA توليفها حديثا في خلايا فردية باستخدام التضخيم إشارة tyramide من ايدو. كانت واحدة من أكبر القضايا خلال الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول نتائج غير متناسقة بين coverslips. تم إجراء تغييرات على عدة بروتوكولات Invitrogen لتجنب الخلط أحجام صغيرة على coverslips الفردية وجعل الحلول الرئيسية لاستخدامها لكافة coverslips. وميكرولتر 75-80 المستخدمة لكل 12 مم ساترة زجاجية دائرية هو حجم مثالي لتغطية كامل مساحة السطح في الوقت الذي توفر حلا كافيا لاعطاء نتائج متسقة بين العينات. وكانت الأمثل مرات الحضانة وتركيزات كاشف لكنها قد تكون رؤية تحسينات مع تعديلات عليها.
ويهدف البروتوكول لتشغيل كل عملية واحدة. ومع ذلك ، فقد تكررت بعض الخطوات مع حلول جديدة لاستعادة العينات التي فشلت بعد المحاولة الأولى. على وجه الخصوص ، وقد تكررت ردود الفعل فوق الخطوات ايدو (3،4-3،6) من دون زيادة كبيرة في مضان الخلفية. المناهضة للحضانة ولاية أوريغون الضد الأخضر HRP (4،1-4،3) والتضخيم tyramide (4،4-4،5) الخطوات التي تكررت أيضا ، ولكن في أكثر الأحيان. النتائج في إشارة إلى نسبة الضوضاء الفقراء بسبب زيادة مضان الخلفية
الكواشف الأكثر حساسية هي الاحتياطي انقر EDU – IT المضافة (G مكون) والمضادة للأرنب أوريغون الأخضر HRP الضد (العنصر الأول) من عدة انقر EDU – IT Microplate الفحص. الاحتياطي انقر ايدو – IT المضافة يتحول تدريجيا مع مرور الزمن الأصفر عند تخزينها في 4 درجات مئوية وبين 6-12 شهرا يظلم كثيرا. تخزين اضغط المضافة لتقنية المعلومات في مخزن ايدو -20 درجة مئوية وسوف تخفف من هذه المسألة. ووضع العلامات والخطوات التضخيم tyramide تعمل بشكل أفضل عندما يتم استخدام المضادة للأرنب أوريغون الأخضر HRP الأضداد في غضون 4-6 أشهر من إعادة تشكيل في 2 MilliQ O. درهم
وسم خفيف من ايدو في و mtDNA يسمح للمقارنات مباشرة مع علامات إضافية الخلوية 11/09 ويعزز من جدوى هذا الأسلوب أكثر من النظير ثيميدين أخرى ، مثل 5 برومو deoxyuridine – 2 (BrdU) ، الأمر الذي يتطلب معاملة قاسية لاسترداد حاتمة لها داخل الحمض النووي. مختبرنا 11-12 13-15 وغيرها قد استخدمت بنجاح لتسمية BrdU و mtDNA. تقنية وضع العلامات BrdU مشابهة لتلك المستخدمة في ايدو ولكن بعض الاختلافات الهامة (الشكل 5). بعد الخطوة permeabilization المذكورة أعلاه (3،1-3،2) ، يتم استرداد حاتمة BrdU مع خطوة تمسخ (2 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تليها ثلاث غسلات في برنامج تلفزيوني 1X). هو المسمى ثم BrdU مع الأجسام المضادة ضد BrdU الابتدائية (مخفف ناقل 01:50 مختبرات في محلول 1 ٪ من حجب عدة TSA وحضنت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية). وهناك حاجة إلى خطوة الضد الثانوية لتضخيم إشارة BrdU (الماعز المضادة للماوس على مترافق مفتش HRP من مجموعات TSA # # 2 و 5 و 1:100 المخفف في محلول 1 ٪ الحجب والمحتضنة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) قبل الخطوات TSA (4،3-4،5 أعلاه). بعد النظير ثيميدين اثنين ، وايدو BrdU ، لو mtDNA التسمية هو مفيد لإجراء التجارب التسمية المزدوجة حيث يمكن تسمية و mtDNA بالتسلسل في النبض وضع العلامات نماذج 11.
مختبرنا يستخدم ايدو وBrdU توسيم و mtDNA لدراسة تنظيم الميتوكوندريا نشوء حيوي في سياق الاعتلال العصبي السكري والمضاعفات الشائعة لمرض السكري. وقد استخدمنا بنجاح تضخيم إشارة إلى قياس التغيرات في نشوء حيوي و mtDNA في الخلايا العصبية الفردية 11-12. هذه التقنية سوف تكون مفيدة في تجارب أخرى تهدف إلى استكشاف آليات النسخ و mtDNA ودوران أو لتحديد الأدوية التي تمنع و mtDNA التوليف. وبالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق المبادئ الأساسية للإشارات وايدو BrdU تضخيم لدراسات أخرى لقياس تكرار الحمض النووي أو إصلاح.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS – 38849 – 076160 وDK ، ومؤسسة أبحاث السكري الأحداث مركز لدراسة مضاعفات في مرض السكري ، وبرنامج للبحوث الأعصاب واكتشاف وألفريد أ. توبمان معهد البحوث الطبية في جامعة ميتشيغان. استخدم هذا العمل المورفولوجيا وصورة كور تحليل ميشيغان مركز الأبحاث والتدريب للسكري ، بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح 5P60 DK – 20572 من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. المؤلفان بالشكر سكوت كلارك T. من المسابر الجزيئية / Invitrogen لنصائحه القيمة في مختلف انقر EDU – IT مجموعات التوسيم والتبرع السخي من الكواشف لدعم التطوير الأولي للتقنية تضخيم ايدو.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 12 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-82 | ||
| 245 mm x 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | ||
| Parafilm M | Fisher Scientific | PM-996 | ||
| paraformaldehye | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8532 | ||
| Phosphate buffered saline 10X solution | Fisher Scientific | BP399 | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-7M | ||
| Hydrogen peroxide, 30% in water | Fisher Scientific | BP2633 | ||
| Click-iT EdU Microplate Assay Kit | Invitrogen | C10214 | ||
| TSA Kit #12, with HRP—goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20922 | ||
| TSA Kit #15, with HRP–goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20925 | ||
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | ||
| Polyclonal rabbit Neurofilament antibody | Chemicon | AB1981 | ||
| Mouse monoclonal anti-BrdU antibody | Vector Laboratories | VP-B209 | ||
| TSA Kit #2, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide | Invitrogen | T20912 | ||
| TSA Kit #5, with HRP—goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide | Invitrogen | T20915 |
References
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).
- Dimmer, K. S., Scorrano, L. (De)constructing mitochondria: what for. Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).
- Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
- Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2′-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations. J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).
- Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels. J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, 626-636 (2008).
- Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In. Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).
- Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells. Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).
- Amiri, M., Hollenbeck, P. J. Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons. Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).
