Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation in einzelnen Zellen von Edu Signalverstärkung

1. Vorbereitung des Neurons Spinalganglion (DRG) Neuronen sind sterile (autoklaviert) 12 mm Deckgläschen in einer 24-well Platte gewachsen. Die 10 mM Bestand von Edu (in DMSO, Click-iT EdU Microplate Assay Kit) ist in der Regel 1:100 in Kulturmedium verdünnt, um eine 10X EdU-Lösung (100 nM) zu machen und dann 1:10 verdünnt in die Kultur-Wells (z. B. 30 ul der 10X EdU Lösung in insgesamt 300 ul Kulturmedium). DRG-Neuronen sind mit einer Endkonzentration von 10 uM EdU bei 37 ° C und 5% CO 2 zwischen 2-24 Stunden. Die Länge der Zeit abhängt, wie Behandlungen auf die Rate der mtDNA-Synthese. In einer Abzugshaube, sind DRG-Neuronen in 2% Paraformaldehyd für 10-15 min bei Raumtemperatur fixiert, zweimal in 1X PBS 2-5 Minuten jede Wäsche und in frischen 1X PBS für bis zu 1 Monat bei 4 ° C. Deckgläser mit spitzen Pinzette, eine vorbereitete feuchte Kammer übertragen (Corning BioAssay Gericht mit schwarzen tapeziert unten für Kontrast, eingewickelt in Alufolie, um Licht empfindliche Bauteile und befeuchtet mit Wasser gesättigt Kimwipes zu schützen) und auf ein Blatt Parafilm M, bietet eine hydrophobe Oberfläche, um die Lösungen zu den Deckglas beschränken. Das Protokoll unten ist für 28 Deckgläser konzipiert und Lösungen sind für 32 Deckgläser (ca. 14% mehr Volumen) vorbereitet. Lösungen mit teuren oder beschränkt Komponenten werden so gefertigt, dass 75-80 ul auf jedem Deckglas verwendet werden. Ansonsten sind 200-300 ul für Wasch-und Block-Lösungen verwendet werden, um gründlich auswaschen bisherigen Lösungen. Re-gelten 1X PBS, um die Oberfläche jedes Deckglas (200-300 ul) zu decken. Bereiten Sie die Click-iT-Assay und Tyramid Signalverstärkung Kits, wie unten beschrieben und in den Anweisungen des Herstellers. Vorbereitung der Click-iT EdU Microplate Assay Kit Die meisten Komponenten aus dem Click-iT EdU Microplate Assay Kit kommen vor und sind bei 4 ° C [2x Click-iT Reaction Buffer (10x Komponente E), CuSO4 (100 mM, Component F), Click-iT EdU Fixativ ( Die Komponente D) und Blocking Buffer (2x Component H)]. Click-iT EdU Buffer Additive (10x Komponente G) wird bei -20 ° C gelagert, um es von sich gelb-braun im Laufe der Zeit zu verhindern. Diese Komponente, wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Die Oregon Green 488 Azid (Komponente B) sollte in kleinen Portionen (10-20 ul) geteilt werden, um Frost-Tau-Zyklen zu minimieren und bei -20 ° C. Zur Vorbereitung einer Stammlösung von der Anti-Oregon Green HRP-Konjugat (Komponente I), fügen Sie 75 ul Milli Q dH 2 O in das Fläschchen. Mix von sanften Pipettieren oder durch Umdrehen Schaumbildung zu vermeiden und lagern bei 4 ° C. Nicht vortexen. Vorbereitung der TSA Kit Nr. 12, mit HRP Goat Anti-Rabbit IgG und Alexa Fluor 488 Tyramid Kit Zur Vorbereitung der Tyramid Stammlösung lösen sich die festen Stoffe (Alexa Fluor 488 Tyramid, Komponente A) in 150 ul DMSO (Komponente B). Drehen Sie die Durchstechflasche einige Male zu lösen jede Tyramid Beschichtung den Seiten des Fläschchens. Lagerung der Stammlösung in kleinen Portionen (10-20 ul) bei ≤ -20 ° C, getrocknet und vor Licht geschützt. 2. Click-iT 5-Ethinyl-2-desoxyuridin (EDU) Labeling Hinweis: Alle Lösungen sind mit einer Glühbirne Transferpipette mit 200 ul Spitze angebracht, um das Ende zu entfernen sanft Flüssigkeiten ohne Zellen entfernt. Vermeiden Sie die Verwendung eines Vakuums Linie, die in der Regel zu entfernen Lösungen zu heftig. Ein Vollpipette wird verwendet, um sanft Flut Deckgläser mit 200-300 ul der Waschlösungen gründlich auswaschen der bisherigen Lösung. Die Zellen werden mit 0,1% Triton-X-100 in 1X PBS-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer bedeckt permeabilisiert. Verwenden Sie 1% Triton-X-100 Stammlösungen. Machen Sie 3000 &mgr; l 0,1% Triton-X-100 durch Zugabe von 300 ul 1% Triton-X-100 Lager zu 2700μL 1X PBS. Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. Entfernen Sie den Triton X-100-Lösung und spülen Sie zweimal mit 1X PBS. Endogene Peroxidase-Aktivität wird durch eine 1% H 2 O 2 in 1X PBS-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur abgeschreckt. Verdünnen Sie 30% H 2 O 2-Lösung mit 1X PBS. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden, sondern können während der 10 Minuten Permeabilisierung Schritt vor (Schritt 3,1) vorgenommen werden. Machen Sie 3000 ul einer 1% igen H 2 O 2 durch Zugabe von 100 ul 30% H 2 O 2 bis 2900 ul 1X PBS. Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. Entfernen Sie die Peroxidase-Lösung und spülen Sie zweimal mit 1X PBS. Click-iT EdU Reaction Für 32 Deckgläser (32 x 80 ul =2560 ul) insgesamt von 2560 ul erforderlich ist. Die 2x Reaktion ist in 1280 ul, der die Hälfte des Gesamtvolumens der Reaktion ist. Frisch bereitet die Click-iT Reaction Cocktail vor dem Start des 5 Minuten post fix (Schritt 3.5). Mischen Sie die Cocktail-und Abpipettieren. Nicht vortexen bei der Bereitstellung dieser Reaktion. 2 x Reaction Cocktail Die Komponenten sind von Click-iT EdU Microplate Assay Kit Die Hälfte Volume: 1280 ul Milli Q dH 2 O 1132,8 ul 2x Click-iT Reaction Buffer (10x Komponente E) 100,3 ul Click-iT EdU Buffer Additive (10x Komponente G) 25,6 ul CuSO 4 (100 mM, Component F) 25,6 ul Oregon Green Azid (Komponente A) 6,4 ul Gesamt 1290,7 ul HINWEIS: Die Volumina eingesetzt oben sind proportional zu den Volumina in den Click-iT EdU Microplate Assay Kit Richtungen aufgeführt. Das Endvolumen der Reaktion Cocktail ist etwas mehr als 1280 ul. Der 2X Click-iT Reaktion wird mit dem gleichen Volumen von Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) unmittelbar vor der Verwendung verdünnt. Das Mischen dieser zusammen macht eine einheitliche Reaktion Lösung für alle Deckgläser. Add 1290,7 uL Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) auf die 1290,7 ul Reaktion Cocktail. Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. Post-fix die Neuronen mit Click-iT EdU Fixativ (Komponente D) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie fix und fügen Reaktion Cocktail von oben (Schritt 3,4). Abdeckung zum Schutz vor Licht und Inkubation für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig die Reaction Cocktail. Zweimal waschen mit verdünnter 1X Blocking Buffer (2x Component H). Machen Sie 5200 ul 1X Blocking Buffer durch Verdünnung 2600 ul Blocking Buffer (2x Component H) mit dem gleichen Volumen MilliQ d H 2 O (2600 ul). Verwenden 75-80 mL pro Deckglas. Im Rahmen eines epi-Fluoreszenz-Mikroskop für Oregon Green Färbung in den Kernen von mitotisch aktiven Kontroll-Zellen zu überprüfen. 3. Tyramid Signalverstärkung (TSA) der EDU Signal Add 1% TSA-Block-Lösung in jede Deckglas und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Machen Sie 6000 ul 1% TSA-Block-Lösung durch Wiegen 0,06 g TSA Blocking Reagent (TSA-Kit Nr. 12, Komponente D) und das Hinzufügen zu 6000 ul 1X PBS. Vortex mischen. Zugabe von 5% Ziegenserum in der 1%-TSA-Block-Lösung wird oft dazu beitragen, unspezifische Bindung zu reduzieren. Kurz Spin der Anti-Oregon Green Meerrettichperoxidase konjugierten Antikörper Lager (Komponente I der Click-iT EdU Microplate Assay), hergestellt 2-24 Stunden im Voraus von TSA. Verdünnen Sie den Primärantikörper 1:300 in 1% TSA blockiert und Invertzuckersirup oder Pipette auf und ab sanft zu mischen. Nicht vortexen zu verhindern, dass die HRP-konjugierten Antikörper. Nehmen Sie 1% TSA-Block-Lösung, fügen Sie 75 &mgr; l jedes Deckglas beimpft und über Nacht bei 4 ° C. Der verwendete Antikörper können mehr konzentriert werden, wie z. B. 1:150, aber es ist in begrenzten Mengen geliefert, so sollten Sie sie sparsam. Auch hier wird der Zugabe von 5% Ziegenserum in der 1%-TSA-Block-Lösung helfen oft unspezifische Bindung des anti-Oregon Green Meerrettichperoxidase konjugierten Antikörper zu reduzieren. Machen Sie 2560 ul einer 1:300-Antikörper-Lösung durch Zugabe von 8,53 ul der Aktie Rabbit anti-Oregon Green-HRP (Click-iT EdU Microplate Assay) bis 2560 ul 1% TSA Blocking. Mix von sanften Pipettieren oder Inversion. Am nächsten Tag, entfernen Sie die Antikörper-Lösung und spülen Sie dreimal mit 1X PBS. Inkubieren Sie die Deckgläser in der letzten Wäsche für eine weitere 30-60 Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass ungebundene Primärantikörper entfernt wird. Bereiten Tyramid Reaktion von 2560 ul (32 Deckgläser x 80 mL). Machen Sie 400 ul einer 0,15% H 2 O 2-Lösung (100X) durch Zugabe von 2 ul der 30% H 2 O 2 (TSA-Kit Nr. 12, Component F) bis 398 ul Amplification Buffer (TSA-Kit Nr. 12, Komponente E) . Dies sollte unmittelbar vor erforderlich sein. Für ein Endvolumen von 2560 ul kombinieren: 25,6 ul Tyramid-488 (TSA-Kit Komponente A) 2508,8 uL Amplification Buffer (TSA-Kit Komponente E) 25,6 ul 0,15% H 2 O 2 (von oben für eine endgültige 0,0015% H 2 O 2) Entfernen 1X PBS und Inkubation mit dem Tyramid Reaktion für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Tyramid Reaktion und spülen dreimal mit 1X PBS, Inkubation in der letzten Wäsche für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur wie zuvor. Prüfen Sie, ob mtDNA Kennzeichnung unter einem epi-Fluoreszenz-Mikroskop. Berg Deckgläser auf Objektträger aus Glas mit einem Antifade Eindeckmedium, wie ProLong Gold mit DAPI. Alternativ kann der EDU Kennzeichnung und Verstärkung durch Standard-Leuchtstofflampen Immunzytochemie zu anderen zellulären Marker Etikett beachten. 4. Repräsentative Ergebnisse: Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation als Marker für die mitochondrialen Biogenese Wir sind daran interessiert, wie sensorische Neuronen (Abbildung 1) regelt die Anzahl der Mitochondrien. Dieses Protokoll wird neu synthetisierten mtDNA mit einem fluoreszierenden Marker-Label als eine Möglichkeit zur Messung der neuen Mitochondrien. Die Einbeziehung der synthetische Nukleotid EdU durch die Klick-Chemie der Oregon Green-Azid und nachfolgenden Amplifikation mit den Alexa-Fluor 488 Tyramid Ergebnisse in der Etikettierung von mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals (Abbildung 2). Wenn es richtig gemacht, ist das verstärkte grüne Signal ausreichend höher als Hintergrund-Fluoreszenz (wie zelluläre Autofluoreszenz oder ein Nebeneffekt der HRP-TSA-Reaktion). Diese Technik wurde entwickelt, um neu repliziert mtDNA-Label, um zu visualisieren und zu quantifizieren mtDNA Biogenese in subzellulären Kompartimenten von Neuronen (Abbildung 3). Die EDU Kennzeichnung ermöglicht anschließende Fluoreszenz-Immunzytochemie zu anderen zellulären Marker wie Neurofilament (Abbildung 3D) Label. Die TSA Reaktion kann auch mit anderen fluoreszierenden Alexa Fluor tyramides wie Alexa Fluor 594-Tyramid durchgeführt werden. Daraus ergibt sich ein grün fluoreszierendes nuklearen Signal von der Oregon Green-Azid-Klick-Reaktion in den Zellkern, aber kein grünes Signal in mtDNA, die nachweisbar vor TSA ist. Die Verstärkung mit Alexa Fluor 594-Tyramid intensiviert die nukleare Label und zeigt die eingearbeitet EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal (Abbildung 4). Eine ähnliche Verstärkung Verfahren verwendet wird, um BrdU-Einbau in neu synthetisierte mtDNA (Abbildung 5) sichtbar zu machen, jedoch erfordert diese Methode einen weiteren Schritt auf die BrdU-Epitop entweder durch eine harte Säure (HCl) oder Enzym verdauen, die nicht für EdU notwendig erholen Kennzeichnung. Abbildung 1. Vertreter Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder von embryonalen (links) und Erwachsenen (rechts) Spinalganglien (DRG) Neuronen, die normalerweise für die Analyse. Bars = 10 pm eingesetzt werden. Abbildung 2. Schematische Darstellung, die die Verfahren zur Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals. Die schematische stellt den Drei-Stufen-Protokoll für die Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einem grün fluoreszierenden Signals. Mitotisch aktiven F11 Neuroblastom-Zellen dienen als positive Kontrolle und illustrieren die Kennzeichnung Muster EdU, dass in Kern-und Mitochondrien-DNA eingebaut wurde. Der erste Schritt (P1) ist ein Thymidin-Analogon in neu synthetisierte mtDNA integrieren durch Inkubation von Zellen in Anwesenheit von EDU. Der zweite Schritt (P2) wird auf Klick-Chemie eingebaut EdU mit Oregon Green-Azid-Label basiert. Grün-Signal wird sichtbar in den Kernen der Zellen, ihre Kern-DNA repliziert. Der letzte Schritt (P3) ist mit dem Oregon Gr verstärkeneen-Azid-Signal durch Inkubation mit einem HRP-konjugierten Kaninchen-Antikörper gegen Oregon Green gefolgt von Inkubation mit Alexa Fluor 488 markierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu grün-Signal in mtDNA zu visualisieren. Abbildung 3. EdU Kennzeichnung von mtDNA in Spinalganglien (DRG) Neuronen. Neuronen sind mit der EDU inkubiert und das Signal wird anschließend verstärkt auf mtDNA, die eingearbeitet EdU offenbaren. Vertreter Fluoreszenzbilder auf Durchlicht zeigt grün punktförmige Signale verstärkt EDU (Edu-OG-TSA, grün) in neu synthetisierte mtDNA sowohl embryonale (A) und Erwachsenenbildung (BD) DRG-Neuronen aufgenommen überlagert. Die EDU Kennzeichnung Verfahren ermöglicht die anschließende Immunfluoreszenzfärbung der neuronalen Marker wie Neurofilament (D, αNF, in rot). Maßstabsbalken = 10 pm. Abbildung 4. Schematische Darstellung, die die Verfahren zur Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal. Die schematische stellt den Drei-Stufen-Protokoll für die Kennzeichnung EdU in mtDNA mit einer roten Fluoreszenz-Signal. Mitotisch aktiven F11 Neuroblastom-Zellen dienen als positive Kontrolle und illustrieren die Kennzeichnung Muster EdU, dass in Kern-und Mitochondrien-DNA eingebaut wurde. Der erste Schritt (P1) ist ein Thymidin-Analogon in neu synthetisierte mtDNA integrieren durch Inkubation von Zellen in Anwesenheit von EDU. Der zweite Schritt (P2) wird auf Klick-Chemie eingebaut EdU mit Oregon Green-Azid-Label basiert. Grün-Signal wird sichtbar in den Kernen der Zellen, ihre Kern-DNA repliziert. Der letzte Schritt (P3) ist mit dem Oregon Green-Azid-Signal durch Inkubation mit einem HRP-konjugierten Kaninchen-Antikörper gegen Oregon Green verstärken, gefolgt von Inkubation mit Alexa Fluor 594 markierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu visualisieren rotes Signal in mtDNA. Abbildung 5. BrdU-Markierung und Tyramid Signalverstärkung mit einem grünen oder roten Fluoreszenz-Signal in mtDNA. Die schematische Darstellung stellt das Verfahren für die Kennzeichnung BrdU in neu synthetisierte mtDNA entweder mit einem grünen oder roten Fluoreszenz-Signal. Ein erster Schritt ist erforderlich, um die BrdU-Epitop entweder durch eine Säure (HCl) oder Enzym verdauen, die nicht notwendig ist für EdU Kennzeichnung erholen. Der nächste Schritt ist mit einer Maus primären anti-BrdU-Antikörper inkubiert. Dies wird durch Inkubation mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Ziege anti-Maus-Antikörper. Schließlich wird das Signal mit einem grünen oder roten fluoreszenzmarkierten Tyramid in Gegenwart von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) zu signalisieren, in mtDNA visualisieren verstärkt.