Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת
Summary
אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.
Abstract
בידוד של הציטופלסמה axonal טהור (axoplasm) מתוך עצב היקפי הוא קריטי עבור מחקרים ביוכימיים של תהליכים ביולוגיים רבים. במאמר זה, אנחנו מדגימים ולתאר פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגרים המבוססת על הצעדים הבאים: (1) דיסקציה של fascicles עצב והפרדה של רקמות החיבור, (2) הדגירה של קטעים קצרים של fascicles העצב בינוני hypotonic לשחרר את המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים; ו (3) מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים. אפיון proteomic וביוכימיות של הכנה זו אישרה רמה גבוהה של העשרת עבור רכיבים axonal.
Protocol
Discussion
מנתח ביוכימיים ו proteomic אישרו כי הליך זה מפחית את זיהום תא בסרום גליה 3 לעומת השיטות שתוארו בעבר על ידי בידוד axoplasm לסחוט מכני 1. השתמשנו בפרוטוקול זה בידוד axoplasm לחקור dynein מבוססי איתות מדרדר לאחר פגיעה עצבית sciatic 2, מצפה שיהיה השירות בחקר של תהליכים רבים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
- Male Wistar rats (8-10 weeks old)
- PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
- Eppendorfs for 1.5 ml
- Sterilized plastic dishes 35 mm
- Dissecting tools including: scissors and fine forceps
- Binocular and table light
Antibodies
Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).
References
- Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve. Neuron. 40, 1095-1104 (2003).
- Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).
- Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axoplasm isolation from peripheral nerve. Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).
- Twiss, J. L., Fainzilber, M. Ribosomes in axons–scrounging from the neighbors. Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).
