Seleção de Aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer
Summary
Aptâmeros são ribo-/deoxyribo-oligonucleotides curtas selecionados por<em> In-vitro</em> Métodos de evolução com base na afinidade por um alvo específico. Aptâmeros são ferramentas de reconhecimento molecular com o versátil aplicações terapêuticas, de diagnóstico e pesquisa. Demonstramos métodos de selecção dos aptâmeros para a proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer.
Abstract
Doença de Alzheimer (DA) é uma progressiva, dependente da idade desordem, neurodegenerativas com um curso insidioso que torna seu diagnóstico pré-sintomático difícil 1. AD diagnóstico definitivo é obtido post-mortem só, estabelecendo assim o diagnóstico, pré-sintomático precoce da AD é crucial para o desenvolvimento e administração de terapias eficazes 2,3.
Β-amilóide-proteína (Aâ) é central para a patogênese AD. Solúvel, oligomérica assembléias Aâ Acredita-se que afetam a disfunção subjacente neurotoxicidade sináptica e perda de neurônios na AD 4,5. Várias formas de assembléias Aâ solúveis têm sido descritos, no entanto, suas inter-relações e relevância para a etiologia e patogenia AD são complexas e não bem compreendido 6. Ferramentas específicas de reconhecimento molecular pode desvendar as relações entre os conjuntos Aâ e facilitar a detecção e caracterização destes conjuntos no início do curso da doença antes que os sintomas surjam. Reconhecimento molecular comumente se baseia em anticorpos. No entanto, uma classe alternativa de ferramentas de reconhecimento molecular, aptâmeros, oferece vantagens importantes em relação aos anticorpos 7,8. Aptâmeros são oligonucleotides gerados por in-vitro de seleção: a evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) 9,10. SELEX é um processo iterativo que, semelhante à evolução darwinista, permite a amplificação de seleção, o enriquecimento, ea perpetuação de uma propriedade, por exemplo, ávido, específico, ligante de ligação (aptâmeros) ou atividade catalítica (ribozimas e DNAzymes).
Apesar da emergência de aptâmeros como ferramentas em biotecnologia moderna e da medicina 11, eles têm sido subutilizados no campo amilóide. RNA poucos ou aptâmeros ssDNA foram selecionados contra diversas formas da proteína príon (PrP) 12-16. Um aptamer RNA recombinante contra gerada PrP bovina foi mostrado para reconhecer bovina PrP-β 17, um solúvel, oligomérica, β-folhas ricas variante conformacional de full-length PrP que forma fibrilas amilóides 18. Aptâmeros gerados usando formas monomérica e vários de β fibrilar 2-microglobulina (β 2 m) foram encontradas para ligar fibrilas de algumas outras proteínas amiloidogênicas além β 2 m fibrilas 19. Ylera et al. descrito aptâmeros RNA selecionada imobilizada contra monomérica Aβ40 20. Inesperadamente, esses aptâmeros ligado fibrilar Aβ40. Em conjunto, esses dados levantam várias questões importantes. Por que aptâmeros selecionados contra proteínas monoméricas reconhecer suas formas poliméricas? Poderia aptâmeros contra as formas monoméricas e / ou de proteínas oligoméricas amiloidogênicas ser obtido? Para responder a essas questões, buscou-se selecionar aptâmeros para covalentemente estabilizado oligomérica Aβ40 21 gerados usando foto-induzida cross-linking de proteínas não modificadas (picup) 22,23. Similar aos resultados anteriores 17,19,20, esses aptâmeros reagiu com fibrilas de Aâ e várias outras proteínas amiloidogênicas provável o reconhecimento de um amilóide potencialmente estrutural comum aptatope 21. Aqui, apresentamos a metodologia SELEX utilizados na produção destes aptâmeros 21.
Protocol
Discussion
O ponto de partida do processo SELEX é a síntese de uma biblioteca de oligonucleotídeos aleatórios tipicamente contendo 10 12 -10 15 seqüências. No DNA SELEX, esta biblioteca é usada diretamente depois de um pool de ssDNA é gerada, enquanto que no RNA SELEX, demonstrado aqui, a biblioteca ssDNA é convertido primeiro a um pool de RNA enzimaticamente por in-vitro de transcrição. Então, é realizada iterativamente SELEX que cada ciclo compõe a exposição e ligação de oligonucl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi suportado por concessões de NIH AG030709 / NIA e 07-65798 do Departamento de Saúde Pública da Califórnia. Reconhecemos Margaret M. Condron para peptídeo síntese e análise de aminoácidos, Dr. Elizabeth Neufeld F. para ajudar e apoiar os passos iniciais do projeto, Dr. Chi-Hong B. Chen para dar suporte e reagentes, e André, Dr. D . Ellington para discussões úteis.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | ||
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | |||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | ||
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815 | ||
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Scientific | 20449 | ||
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | ||
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | ||
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa | |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | ||
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman | |||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′ | |
| Taq DNA polymerase | USB Corporation | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. | |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corporation | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′ | |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′ | |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | QIAGEN | 28104 | ||
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | ||
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | ||
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water | |
| α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | Perkin Elmer | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) | |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma (Fluka) | 77619 | ||
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma | C0549 | ||
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma | E7023 | ||
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | ||
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide | |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | ||
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | ||
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | ||
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | ||
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | ||
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell | |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness | |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham Biosciences | RPN3114K | Can be used under red safe light. | |
| Membrane discs | Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes | |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR | 26316-696 | ||
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | ||
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | ||
| Glycogen | Sigma | G1767 | ||
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma | I9516 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega | A3802 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corporation | 77524 |
References
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