מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר
Summary
Aptamers הם ribo-/deoxyribo-oligonucleotides קצר נבחר על ידי<em> חוץ גופית</em> שיטות האבולוציה מבוסס על זיקה יעד ספציפי. Aptamers הם כלים לזיהוי מולקולרי עם יישומים טיפולית, אבחון, מחקר מגוונות. אנו מדגימים שיטות הבחירה של aptamers לחלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר.
Abstract
מחלת אלצהיימר (AD) הוא פרוגרסיבי, תלויי גיל, הפרעת ניווניות עם קורס חתרני שהופכת presymptomatic האבחנה שלה קשה 1. אבחנה ברורה לספירה מושגת רק נתיחה שלאחר המוות, ובכך לבסס אבחנה presymptomatic, מוקדם של אלצהיימר הוא חיוני לפיתוח טיפולים יעילים לניהול 2,3.
עמילואיד β-חלבון (Aβ) הוא מרכזי בהיווצרות לספירה. מסיסים, מכלולים Aβ oligomeric הם האמינו הבסיסית neurotoxicity להשפיע על תפקוד סינפטי ואיבוד נוירון לספירה 4,5. צורות שונות של מכלולים Aβ מסיסים תוארו, לעומת זאת, יחסי הגומלין שלהם רלוונטיות האטיולוגיה לספירה בפתוגנזה הם מורכבים ולא הבין היטב 6. כלים ספציפיים ההכרה המולקולרית עשויה לפתור את היחסים בין מכלולים Aβ ולאפשר זיהוי ואפיון של מכלולים אלה מוקדם במהלך המחלה לפני שהתסמינים מופיעים. הכרה מולקולרית בדרך כלל מסתמכת על נוגדנים. עם זאת, מעמד חלופי של כלי הכרה, aptamers מולקולרית, מציעה יתרונות חשובים ביחס נוגדנים 7,8. Aptamers הם oligonucleotides שנוצר על ידי בחירה ב-vitro: התפתחות שיטתית של ligands על ידי העשרה מעריכי (Selex) 9,10. Selex היא תהליך חוזר ונשנה זה, בדומה לאבולוציה הדרווינית, מאפשר בחירה, הגברה, העשרה, והנצחה של הנכס, למשל, נלהב, ספציפית, מחייב ליגנד (aptamers) או פעילות קטליטית (ribozymes ו DNAzymes).
למרות הופעתה של aptamers ככלים בתחום הביוטכנולוגיה והרפואה המודרנית 11, הם כבר לא מנוצלים בתחום עמילואיד. RNA מעטים או aptamers ssDNA נבחרו נגד צורות שונות של חלבונים Prion (PRP) 12-16. Aptamer RNA שנוצר נגד PRP רקומביננטי שור הוצגה להכיר שור PRP-β 17, מסיסים, oligomeric, גיליון β-עשירים גרסה קונפורמציה של PRP באורך מלא שנוצר סיבי עמילואיד 18. Aptamers שנוצר באמצעות טפסים monomeric וכמה סיבי β 2-microglobulin (β 2 מ ') נמצאו לאגד הסיבים של חלבונים מסוימים amyloidogenic אחרים מלבד β 2 מ' הסיבים 19. Ylera et al. תיאר aptamers RNA שנבחר נגד משותקת monomeric Aβ40 20. באופן בלתי צפוי, aptamers אלה קשורים סיבי Aβ40. בסך הכל, הנתונים הללו מעלים שאלות חשובות. מדוע נבחר aptamers נגד חלבונים monomeric לזהות צורות פולימריות שלהם? יכול aptamers נגד צורות monomeric ו / או oligomeric של חלבונים amyloidogenic לקבל? כדי לענות על השאלות האלה, ניסינו לבחור aptamers עבור קוולנטית מיוצב oligomeric Aβ40 21 שנוצר באמצעות תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) 22,23. בדומה לממצאים קודמים 17,19,20, aptamers אלה הגיבו הסיבים של Aβ וכמה חלבונים אחרים amyloidogenic סביר הכרה עמילואיד משותף פוטנציאלי מבניים aptatope 21. כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה Selex המשמשים לייצור של אלה aptamers 21.
Protocol
Discussion
נקודת המוצא של התהליך Selex הוא סינתזה של ספריה oligonucleotide אקראי המכיל בדרך כלל 10 -10 12 15 רצפים. ב-DNA Selex, ספריה זו משמשת מיד לאחר בריכה ssDNA שנוצר, ואילו RNA Selex, הפגינו כאן, הספרייה ssDNA מומר הראשון בריכת RNA enzymatically ידי שעתוק חוץ גופית. ואז, Selex מבוצע iteratively לפיה כל מחזור כו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AG030709 מ-NIH / NIA ו 07-65798 מן המחלקה לבריאות הציבור בקליפורניה. אנו מכירים מרגרט מ Condron לסינתזה פפטיד וניתוח חומצת אמינו, ד"ר אליזבת פ 'נויפלד לסיוע ותמיכה בשלבים הראשוניים של הפרויקט, ד"ר צ'י קונג ב חן למתן תמיכה ריאגנטים, וד"ר אנדרו D . אלינגטון לדיונים מועילים.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | ||
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | |||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | ||
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815 | ||
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Scientific | 20449 | ||
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | ||
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | ||
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa | |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | ||
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman | |||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′ | |
| Taq DNA polymerase | USB Corporation | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. | |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corporation | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′ | |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′ | |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | QIAGEN | 28104 | ||
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | ||
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | ||
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water | |
| α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | Perkin Elmer | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) | |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma (Fluka) | 77619 | ||
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma | C0549 | ||
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma | E7023 | ||
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | ||
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide | |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | ||
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | ||
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | ||
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | ||
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | ||
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell | |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness | |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham Biosciences | RPN3114K | Can be used under red safe light. | |
| Membrane discs | Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes | |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR | 26316-696 | ||
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | ||
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | ||
| Glycogen | Sigma | G1767 | ||
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma | I9516 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega | A3802 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corporation | 77524 |
References
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer’s disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer’s disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
- Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer’s disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
- Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer’s disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
- Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
- Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
- Rhie, A. Characterization of 2′-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
- King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
- Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
- Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
- Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
- Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
- Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer’s disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
- Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
- Adams, D. S. . Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , (2003).
- Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
- Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).
