Sélection d'aptamères pour amyloïde β-protéine, l'agent causal de la maladie d'Alzheimer
Summary
Les aptamères sont sélectionnés par ribo-/deoxyribo-oligonucleotides courte<em> In-vitro</em> Les méthodes basées sur l'évolution affinité pour une cible spécifique. Les aptamères sont des outils de reconnaissance moléculaire avec polyvalente applications thérapeutiques, diagnostiques et de recherche. Nous démontrons méthodes de sélection des aptamères pour amyloïde β-protéine, l'agent causal de la maladie d'Alzheimer.
Abstract
La maladie d'Alzheimer (MA) est une progressive, dépendant de l'âge, maladie neurodégénérative avec une évolution insidieuse qui rend son diagnostic présymptomatique difficiles 1. AD diagnostic définitif est réalisé l'autopsie seulement, établissant ainsi présymptomatique, le diagnostic précoce de la MA est crucial pour développer et administrer des traitements efficaces 2,3.
Amyloïde β-protéine (Aß) est au centre de la pathogenèse AD. Soluble, oligomérique assemblées Aßi auraient des effets sur la neurotoxicité dysfonction sous-jacente synaptique et la perte de neurones dans l'AD 4,5. Diverses formes de Aß solubles assemblées ont été décrits, cependant, leurs interrelations et de la pertinence de l'étiologie et la pathogenèse AD sont complexes et mal comprises 6. Des outils spécifiques de reconnaissance moléculaire peut démêler les relations entre les assemblées Aßi et de faciliter la détection et la caractérisation de ces assemblées au début de l'évolution de la maladie avant que les symptômes apparaissent. La reconnaissance moléculaire s'appuie souvent sur des anticorps. Cependant, une autre classe d'outils de reconnaissance moléculaire, des aptamères, offre des avantages importants par rapport aux anticorps 7,8. Les aptamères sont des oligonucléotides générés par la sélection in vitro: l'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) 9,10. SELEX est un processus itératif qui, semblable à l'évolution darwinienne, permet la sélection, d'amplification, d'enrichissement, et la perpétuation d'une propriété, par exemple, avide, ligand spécifique, contraignant (aptamères) ou de l'activité catalytique (ribozymes et ADNzymes).
Malgré l'émergence d'aptamères comme outils de la biotechnologie moderne et la médecine 11, ils ont été sous-utilisés dans le domaine de l'amyloïde. Peu ou ARN aptamères ADNss ont été sélectionnés contre les différentes formes de protéines du prion (PrP) 12-16. Un aptamère ARN générés contre la PrP recombinante bovine a été montré à reconnaître la PrP bovine β-17, une forme soluble, oligomérique, β-feuille riche en variantes de conformation de la PrP pleine longueur qui forme des fibrilles amyloïdes 18. Les aptamères générés en utilisant les formes monomériques et plusieurs de β 2-microglobuline fibrillaire (β 2 m) ont été trouvés pour lier les fibrilles de certaines autres protéines amyloïdogéniques dehors β 2 m 19 fibrilles. Ylera et al. décrit aptamères d'ARN sélectionnés contre immobilisé monomère Aß40 20. De façon inattendue, ces aptamères liés fibrillaire Aß40. Au total, ces données soulèvent plusieurs questions importantes. Pourquoi aptamères sélectionnés contre des protéines monomériques reconnaître leurs formes polymères? Pourriez aptamères contre les formes monomères et / ou oligomères de protéines amyloïdogéniques être obtenus? Pour répondre à ces questions, nous avons tenté de sélectionner des aptamères pour covalente stabilisée oligomères Aß40 21 généré en utilisant la photo-induite de réticulation des protéines non modifiées (PICUP) 22,23. Similaires aux constatations antérieures 17,19,20, ces aptamères ont réagi avec des fibrilles de Aß et de plusieurs autres protéines amyloïdogéniques susceptible de reconnaître une substance amyloïde potentiellement communes structurelles aptatope 21. Ici, nous présentons la méthodologie utilisée dans la production SELEX de ces aptamères 21.
Protocol
Discussion
Le point de départ du processus SELEX est la synthèse d'une bibliothèque d'oligonucléotides aléatoires contenant typiquement 10 12 -10 15 séquences. Dans l'ADN SELEX, cette bibliothèque est utilisée directement après une piscine ADNss est généré, alors que dans l'ARN SELEX, démontré ici, la bibliothèque ADNss est convertie d'abord à un pool d'ARN enzymatiquement par transcription in vitro. Puis, SELEX est réalisé itérativement lequel chaq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH AG030709 / NIA et 07-65798 du California Department of Public Health. Nous reconnaissons Margaret M. Condron pour la synthèse peptidique et de l'analyse des acides aminés, le Dr Elizabeth F. Neufeld pour les aider et de soutenir les premières étapes du projet, le Dr Chi-Hong Chen B. de fournir un soutien et des réactifs, et le Dr Andrew D . Ellington pour les discussions utiles.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | ||
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | |||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | ||
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815 | ||
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Scientific | 20449 | ||
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | ||
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | ||
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa | |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | ||
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman | |||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′ | |
| Taq DNA polymerase | USB Corporation | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. | |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corporation | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′ | |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′ | |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | QIAGEN | 28104 | ||
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | ||
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | ||
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water | |
| α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | Perkin Elmer | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) | |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma (Fluka) | 77619 | ||
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma | C0549 | ||
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma | E7023 | ||
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | ||
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide | |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | ||
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | ||
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | ||
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | ||
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | ||
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell | |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness | |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham Biosciences | RPN3114K | Can be used under red safe light. | |
| Membrane discs | Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes | |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR | 26316-696 | ||
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | ||
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | ||
| Glycogen | Sigma | G1767 | ||
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma | I9516 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega | A3802 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corporation | 77524 |
References
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