اختيار الأبتامرات للبروتين اميلويد - β ، والمسبب لمرض الزهايمر
Summary
الأبتامرات هي ribo-/deoxyribo-oligonucleotides القصيرة المختارة من قبل<em> في المختبر</em> تطور الأساليب على أساس تقارب لهدف محدد. الأبتامرات هي أدوات متعددة الاستخدامات مع الاعتراف الجزيئية التطبيقات العلاجية والتشخيصية ، والبحوث. نظهر طرق لاختيار الأبتامرات للبروتين اميلويد β ، العامل المسبب للمرض الزهايمر.
Abstract
مرض الزهايمر (ميلادي) هو التقدمية ، التي تعتمد على العمر ، واضطراب الاعصاب مع دورة الغادر الذي يجعل من الصعب تشخيصه سابق للأعراض 1. ويتحقق تشخيص محدد ميلادي بعد الوفاة فقط ، وبالتالي وضع سابق للأعراض ، والتشخيص المبكر للميلادي أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة وبالإدارة 2،3.
β البروتين اميلويد (Aβ) أمر أساسي لالمرضية ميلادي. ويعتقد ، oligomeric ذوبان المجالس Aβ أن يؤثر ضعف العصبية الكامنة متشابك وفقدان الخلايا العصبية في 4،5 م. وقد وصفت مختلف أشكال التجمعات Aβ القابلة للذوبان ، ومع ذلك ، ترابطها وصلتها المسببات المرضية ميلادي ومعقدة وغير مفهومة جيدا 6. قد أدوات محددة الاعتراف الجزيئية كشف العلاقات بين المجالس Aβ وتسهيل الكشف وتوصيف هذه المجالس في وقت مبكر من أعراض المرض قبل الدورة الظهور. الاعتراف الجزيئية تعتمد عادة على الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فئة بديلة من أدوات التعرف الجزيئي ، الأبتامرات ، ويقدم مزايا هامة بالنسبة إلى 7،8 الأضداد. [أليغنوكليوتيد] الأبتامرات هي التي تولدها في المختبر الاختيار : التطور المنهجي للتخصيب بواسطة يغاندس الأسي (سيليكس) 9،10. سيليكس هي عملية تكرارية ، مماثلة لنظرية التطور الداروينية ، ويتيح الاختيار ، والتضخيم ، والإثراء ، وإدامة الممتلكات ، على سبيل المثال ، متعطشا ومحددة وملزمة يجند (الأبتامرات) أو أي نشاط الحفاز (ribozymes وDNAzymes).
على الرغم من ظهور الأبتامرات كأدوات في مجال التكنولوجيا الحيوية الحديثة والطب 11 ، وقد كانوا غير مستغلة في مجال اميلويد. وقد تم اختيار عدد قليل أو RNA الأبتامرات ssDNA ضد أشكال مختلفة من بروتينات بريون (بي ار بي) 12-16. وقد أبدت aptamer RNA الناتجة ضد المؤتلف البقري بي ار بي بي ار بي الاعتراف البقري β – 17 ، ، oligomeric القابلة للذوبان ، β ورقة الغنية متعلق بتكوين متغير من كامل طول بي ار بي الذي يشكل ييفات اميلويد 18. ولدت الأبتامرات باستخدام نماذج موحودي والعديد من β ييفي تم العثور على 2 – المكروغلوبولين (β 2 م) لربط ييفات من بروتينات معينة amyloidogenic أخرى إلى جانب β ييفات م 2 19. Ylera وآخرون. وصف الأبتامرات RNA مختارة ضد يجمد 20 Aβ40 موحودي. بشكل غير متوقع ، وهذه الأبتامرات ملزمة لييفي Aβ40. تماما ، وهذه البيانات تثير تساؤلات عديدة هامة. لماذا اختيار الأبتامرات ضد بروتينات موحودي الاعتراف أشكالها البوليمرية؟ ويمكن الحصول على استمارات الأبتامرات ضد موحودي و / أو البروتينات oligomeric amyloidogenic؟ للتصدي لهذه الأسئلة ، وحاولنا تحديد الأبتامرات لتساهميا استقرت 21 Aβ40 oligomeric تم إنشاؤها باستخدام الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) 22،23. مشابهة لنتائج سابقة 17،19،20 ، تفاعلت مع هذه الأبتامرات ييفات Aβ من البروتينات وغيرها من عدة amyloidogenic الاعتراف الأرجح اميلويد مشتركة محتملة الهيكلية aptatope 21. هنا ، فإننا نقدم سيليكس منهجية المستخدمة في إنتاج هذه الأبتامرات 21.
Protocol
Discussion
نقطة الانطلاق لعملية سيليكس هو توليف مكتبة تحتوي على قليل النوكليوتيد عشوائي عادة 10 12 15 -10 متواليات. سيليكس في الحمض النووي ، ويتم استخدام هذه المكتبة مباشرة بعد إنشاء تجمع ssDNA ، في حين سيليكس RNA ، تظاهر هنا ، هو تحويل مكتبة ssDNA أول حمام سباحة إنزيمي بواسطة الحمض ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منح من المعاهد الوطنية للصحة AG030709 / NIA و07-65798 من وزارة الصحة العامة في ولاية كاليفورنيا. نعترف مارغريت M. Condron لتخليق الببتيد وتحليل الحمض الأميني ، الدكتورة اليزابيث واو نويفلد لمساعدة ودعم الخطوات الأولية للمشروع ، والدكتور تشي تشن هونغ باء لتقديم الدعم والكواشف ، والدكتور أندرو دال . إلينغتون لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | ||
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | |||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | ||
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815 | ||
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Scientific | 20449 | ||
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | ||
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | ||
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa | |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | ||
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman | |||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′ | |
| Taq DNA polymerase | USB Corporation | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. | |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corporation | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′ | |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′ | |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | QIAGEN | 28104 | ||
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | ||
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | ||
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water | |
| α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | Perkin Elmer | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) | |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma (Fluka) | 77619 | ||
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma | C0549 | ||
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma | E7023 | ||
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | ||
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide | |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | ||
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | ||
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | ||
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | ||
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | ||
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell | |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness | |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham Biosciences | RPN3114K | Can be used under red safe light. | |
| Membrane discs | Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes | |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR | 26316-696 | ||
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | ||
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | ||
| Glycogen | Sigma | G1767 | ||
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma | I9516 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega | A3802 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corporation | 77524 |
References
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer’s disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer’s disease. Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).
- Kawas, C. H. Clinical practice. Early Alzheimer’s disease. N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid β-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. Paradigm shifts in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies. J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).
- Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer’s disease and related disorders. Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).
- Weiss, S. RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP. J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).
- Bibby, D. F. Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins. J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).
- Rhie, A. Characterization of 2′-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).
- King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites. J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).
- Proske, D. Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation. ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).
- Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity. Prion. 2, 73-80 (2008).
- Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions. J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).
- Bunka, D. H. Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes. J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).
- Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. Selection of RNA aptamers to the Alzheimer’s disease amyloid peptide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).
- Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity. PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides. J. Vis. Exp. , (2009).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).
- Adams, D. S. . Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench. , (2003).
- Gopinath, S. C. Methods developed for SELEX. Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).
- Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ. Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).
