Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Bölüm 1: 594 Alexa Etiketli Embriyolar 1.1 Mikroenjeksiyon Plaka ve İğne Hazırlık Mikroenjeksiyon plakaları yapma Üç beş 1-mm olukları Westerfield, 2007 1 bir teknik kullanarak bir agaroz kalıp içinde oluşan enjeksiyon tabak hazırlayın. Bu olukları snuggly etkin ve sistematik microinjections bir çizgi embriyolar yapacak. Plakalar yapmak için önce, üç 1 mm 4-inç uzun olmayan filament kılcal damarlar ve dikkatle yarısında onları kırmak. Bu 2-inç uzunluğunda kılcal damarların superglue, tutkal iki yan tarafı düz bir yüzey üzerinde. Tutkal üçüncü üç kılcal damarların bir piramit şekli oluşturarak, koru içinde yuvalanmış bu iki üst, kapiller. Kuru ve yeterli "çukur kalıpları" yapılıncaya kadar tekrarlamak için izin verin. Embriyo orta erimiş% 1.5 agaroz (5mm derinlik) 20-25ml dökün (EM) [5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl 2 0.33mM MgSO 4 ve 0.00003% metilen mavisi] 100mm bir petri içine. Hemen plaka alt kalıp petri alt dokunuyor düz tarafı sağlanması için daha önce yapılmış piramit şeklindeki çukur kalıplar 04:57 yerleştirin ve tamamen agaroz ile kaplı. Agaroz katılaşmış, kılcal cam kalıpları dışarı alınmalıdır. Kaldırmak için, üç kılcal kalıpları içeren büyük bir agaroz kare kesip. Yavaşça kesik kare ve atın çevre agar yerinden. Ince forseps kullanarak kare agar üzerinde parça ve Flip, çukur kalıplar tamamen kaldırmak. Yeni kalıp kuyuları yerinde tutmak için meydanın çevresinde petri içine erimiş agaroz dökün. Ayarlamanıza olanak sağlar. Tabaklar, 4 hafta boyunca kapalı ve depolanan parafilm ° C olabilir Agar herhangi bir büyüme belirtileri atın. Microinjections için İğneler. Mikropipet kılcal çektirmenin iç filament ile 1 mm, 4-inç cam kapilerleri gerekli enjeksiyon iğne yapmak kullanın. İğneler Flamming / Kahverengi mikropipet Çektirme 550 ısı kullanılarak çekilmiştir, 120 kuvvet, hız, 200 ve bir zaman / 200 gecikme çekin. 1.2 Embriyo Toplanması ve Mikroenjeksiyon Aparatı Kurulum EM ile dolu bir petri koydu ve korunur sonra döllenmiş yumurta hemen toplanır. Floresan dextrans enjeksiyon tek hücreli aşamada idealdir ve 16-hücreli evre 2 tarafından doldurulmalıdır. Geniş bir ucu cam pipet kullanarak, EM ile dolu bir oda sıcaklığı enjeksiyon plaka kuyu içine embriyolar sınırdışı. Sıktı künt forseps ile yavaşça olukları dibine embriyolar kama. Koryon veya sarısı tehlikeye Embriyolar atılmalıdır. 1-sulandırılmış floresan Alexa 594 çözüm 2μl (0.2 M KCl ağırlığının% 5) ile bir iğne yükleyin. Dekstran enjeksiyon iğnesinin uzunluğu çalışan gömülü filament nedeniyle kılcal etki enjeksiyon iğne ucu seyahat etmek için izin ver. Stereotaktik mikromanipülatör kılcal sahibine bir iğne takın. 40-50 Psi ve darbe süresi 500 milisaniye ile başlayan mikroenjektör aparat üzerindeki baskıyı ayarlayın. Forseps (İdeal çapı 0.05-0.15mm) mühür kırmak için enjeksiyon iğne ucu hafifçe otlatmak. Steromicroscope kullanarak, tepesine iğne kalibre etmek için mineral yağ ile mikrometre üzerine dekstran sınırdışı. Hava basıncı, nabız süresi ve iğne ucu boyutunu ayarlayarak bolus boyutunu değiştirin. 0.8-1nl bir birime eşdeğer bolus enjeksiyonları 3 boyunca sağlanmalıdır. Genellikle ipuçları sarısı parçacıklar tıkanabilir; basıncı ayarlayarak veya iğne ucu kırılma sorunu hafifletmek olabilir, aksi takdirde yeni bir enjeksiyon iğnesi yüklü olmalıdır. Floresan Alexa 594 1.3 Microinjections Yüksek büyütme altında, çukur bir ucundan başlayarak, düzgün bir şekilde delmek embriyo koryon ve hücre zarı sarısı içine girmek için. Hücrenin hemen altında dekstran çözümü enjekte edilir. Aynı pürüzsüz hareketi ile embriyo girmek için kullanılan enjeksiyon iğnesi kaldırmak için emin olun. Sonraki embriyo satır içi konumu ve çukur uzunluğu aşağı enjekte devam petri taşıyın. Periyodik olarak basınç ve bolus boyutunu kontrol edin. Bu ölümcül embriyo ve / zarar veya enjeksiyon iğne kırılması muhtemel olduğu gibi embriyo iken enjeksiyon iğnesi hareket ya da eğmemeye dikkatli olun. Embriyoların olukları forseps ile yavaşça dışarı itmek. Antibiyotik Kalem ile dolu bir petri aktarabilirsiniz / EM Nusslein-Volhard ve Dahm (2002) (1ml 6.5m CaCl 2, 1 ml 3,5 M NaHCO 3, 60mg/ml penisilin, 100mg / 25ml 20x EM ve 10ml açıklanan Adım ml streptomisin stock) daha sonra transplantasyon için hazırlık. 28.5 ° C ve monitör döllenmemiş yumurta veya embriyo ölüm embriyolar inkübe edin. Bölüm 2: Gastrula Sahne transplantasyon 2.1 Dechorionating ve Nakli Plaka Hazırlık 5 dökerek dechorionating plakaları, plakalar Dechorionating epiboly yumuşak bir alt plakası, daha önce açıklanan% 1.5 agaroz çözüm kullanarak kendi sarısı yapışır ve plastic.The gün önce nakli gözyaşı var gerektirmeyen tamamlamamış Dechorionated embriyolar 100mm bir petri içine erimiş agaroz -10 ml. Agaroz sadece ince bir katman (2-3mm) dechorination sırasında embriyoların yastık için gerekli. Soğumasını bekleyin. Nakli plakaları İhtisas plakaları ayrılmış kuyu 4'te açıklandığı gibi yapılması gerekir. 100mm bir petri içine 30 ml% 1.5 agaroz çözüm dökün ve nakli de kalıp bir takın. Kalıp 104 üçgen divots her üç 90 derecelik iki tarafın oluşan ve 45 derece açılı yan içermelidir. Kuyulardan iki embriyo yan tarafında (Şekil 1A, mor kutu) tutmak için tasarlanmıştır. Kalıbın altındaki tuzak hava kabarcıkları dikkat edin. Agaroz sertleşmesine izin verin. Kalıp çıkarma, eğimli bir kenarı ile kare kuyu içeren bir batık alanını ortaya çıkarır. 2.2 Embriyo ve Nakli Aparatı Kurulum Donör ve ev sahibi embriyoların yerleştirilmesi Host ve donörlerin Geliştirme yaş eşleştirilmiş eşleşmeleri yakın korumak için takip edilmesi gerekir. Bunu yapmak için, embriyolar yavaşlatmak veya sırasıyla gelişimi hızlandırmak için farklı sıcaklıklarda (25-31 ° C) büyüdü olabilir. Hem ev sahibi hem donör embriyolar, bu 5hpf tamamlanması gerekir gastrula sahne nakli durumda istenilen yaş öncesinde agar-kaplı dechorionating plaka 1 saat dechorionated el olmalıdır. 5.5hpf host ve donör embriyolar, sahne kalkan önce antibiyotik EM ile dolu bir nakli plakasına yüklenir. Embriyolar bir cam pipet kullanarak bireysel 1 mm kuyu içine yüklenir. Şöyle bir örnek: (iyi bir embriyo ortalama 9 embriyolar, satır başı) ilk satır donör embriyolar ile doludur (toplam 18 sıra her iki embriyo) ve aşağıdaki iki satır ana embriyolar ile doldurulur. Transplant aparat ayarlama Tam otomatik, joystick kontrollü zoom ve odaklama manipülasyon Zeiss Lumar floresan stereo mikroskop nakli yapılmaktadır. Nakli mikroskop bu otomasyon olmadan yapılabilir, dramatik, kolaylığı ve verimliliği yüksek bir sayıda nakli istenen özellikle artırmak. Eppendorf AirTram ölçülerini orta konuma ayarlayın. Kılcal sahibine AirTram (Şekil 1A, kırmızı bir kutu) boru bağlayın ve Eppendorf otomatik mikromanipülatör (Şekil 1A) sahibinin güvenli. Bu mikromanipülatör tam otomatik ve kontrollü joystick. Yine, bu otomasyon tamamen gerekli değildir ama önemli ölçüde embriyo etrafına ve içine iğne gezinmek için olanlar yeteneğini geliştirir. Ancak, biz, AirTram herhangi bir zorluk vardı; Alternatif olarak, birçok araştırmacı hücre toplama yumuşak kontrol sunmak için söylenir OilTram tercih . Kılcal damarların kullanılan, 15 metre eğimli ucu (Şekil 1A yeşil kutu) ucu ve 20 derece bükülmüş açısı 1mm açılması steril Eppendorf TransferTips (ES) . 2.3 Gastrula Sahne Hücre nakli 6hpf anda mikromanipülatör kullanarak hafifçe pozisyonda, orta hat ve kalkan görünür ve kılcal ucu karşı bu tür hücre ekstraksiyon için embriyo döndürmek için kapiler ucu ile embriyo otlatmak. Aspire kapiller içine EM hücrelerine zarar hava-su arayüzü, bağlantı hücreleri herhangi bir şans önlemek için küçük bir miktar. Zebrafish kaderi harita üzerinde, ön beyin hücrelerini hedef tam hayvan kutup ve kalkan 5 arasındaki orta hat hücrelerinin nakli gerektirir . Hafifçe delmek bu konuma donör embriyo ektoderm (rodamin enjekte veya GFP transgenik embriyolar). Gastrula ektoderm ve altta yatan sarısı arasında hücrelerinin kalınlığı incedir, genellikle birkaç saat içinde ölüme yol açacak bu nedenle, yumurta sarısı kazığa oturtmak için dikkatli kullanın. AirTram aspirat hücreleri kılcal yavaş yavaş kullanma. Her zaman su hattı görünürlüğünü korumak. Donör ise ucu hafif ajitasyon hücre-hücre kişileri gevşek yardımcı olacaktır. Donör embriyo yaklaşık 10-50 hücreler embriyo kaldırılmadan önce çıkarılması olmalıdır. Donör, benzer şekilde yönlendirmek ev sahibi ve delgi kılcal çıkarın ve tam olarak sa içine hücreleri sınırdışıbana hayvan kutup ve ev sahibi embriyoların kalkan arasındaki konumu. Transplantasyondan sonra, donör ve host embriyolar kuyulardan kaldırıldı ayrılmış ve antibiyotik EM ile dolu bir agar kaplı petri yavaşça yerleştirilir. Nakli kuyularda embriyolar bırakmak mortaliteyi artırmaktadır. 28,5 az inkübe embriyolar ° C 2.4 görselleştirme ve Görüntüleme Embriyolar Sabit ve canlı embriyoların Montaj. Transgenik GFP veya rodamin enjekte edilen embriyolar türetilen ev sahipliği embriyolar ya da diri olarak sabit embriyolar görüntülenebilmekte ve görüntülü olabilir. Biz burada hem sabit ve canlı görüntüleme seçenekleri örnekler sunuyoruz. Fix embriyolar 4 C 1 gecede 0.1M fosfat tamponu (PB)% 4 paraformadehyde kullanarak 30hpf kurban edildi. 0.1M PB 3 x 5 dakika sonra yıkayın embriyolar 2x ve durulayın. Verdiğimiz örnekte, sabit ev sahipliği Asetillendirilmiş tubulin (α-AT) olarak daha önce 6 açıklanan yöneltilen antikorlar ile tüm aksonlar immunolabeled. % 75 gliserol yerleştirin embriyolar, daha sonra 4 saklamak oda sıcaklığında lavabo ve ° C Iki embriyo monte etmek için bir slayt hazırlayın. Oluşturun iki vazelin kare kare lamel iç şekil ve çap uygun bir slayt özetliyor. Bir embriyo Deyolk ve önbeyin bir ön görünümü için ön beyin, orta beyin karşısında dik keserek teşrih. Bu doku gliserol az miktarda petrol kuyusu içinde yerleştirin. Orient uygun pozisyona doku ve lamel numune üzerine yerleştirin. Canlı örnek Tricaine% 4 (EM) çözüm cam alt kültür yemekleri üzerine yapılan bir% 0,75 'lik agaroz çözüm monte edildi. Agaroz katılaşmadan önce, embriyo görüntüleme için doğru yönlendirmek için bir tungsten iğne ile değiştirilebilir. Lamel karşı doğrudan analizi için ön beyin odaklı. Görüntüleme Her iki sabit ve canlı ana Leica SP5 Lazer Tarama Konfokal Mikroskop kullanarak görüntülü. Z-Yığınları kazanılmış ve 3 – veya 4-boyutlu görüntü işleme Volocity yazılımı kullanılarak tamamlandı. Sonuçlar: Önbeyin Astroglial hücrelerin rolü adresine bir çaba hem küçük kümeler diensefalik ve telencephalic hücreleri ve bu hücrelerin hedef farklı genetik manipülasyonlar görselleştirmek için gereklidir. Kimerik embriyolar bu tür oluşturmak için, hangi embriyonun içinde Astroglial nüfusun bir kısmını olsun, genotip ve fenotip gastrula kullanımı ile astroglia etiketler GFP transgenik embriyolar, kullanımı birleştiren çok yönlü bir yaklaşım, kullanılan farklı hücre nakli düzenledi. Diensefalon bizim klonlar özellikle hedeflemek için, biz hayvan kutup ve kalkan 5 (Şekil 1B) eşit uzaklıkta orta hatta hücrelerin seçici ayıklamak için zebrafish gastrula kaderi harita kullanılmıştır. Çıkartılan bu tg [GFAP: GFP] hücreler daha sonra sonra 30hpf kaldırdı ve ön beyin anatomisi için referans simgesel olarak bütün aksonlar (α-Asetillendirilmiş tubulin) immunolabeled vahşi bir türü konak gastrula, aynı yerde naklediliyor. Burada bir örnek gösterildiği gibi, bir ev sahibi embriyo konfokal görüntüleme telencephalon ve diensefalon (Şekil 2A) boyunca izole GFP + hücreler ortaya koymaktadır. Tam bu GFP + hücrelerinin morfolojisi, bu hücrelerin en karakteristik radyal glial morfolojisi, soma ventrikül bölgesine bitişik bulunan ve büyük bir ucunu ayak radyal işlemi sonlandırır aldığını ifşa bu klonal tayininde görülebilir pial yüzey (Şekil 2A, içerlek). Toplanan bu optik dilim Z-yığın üç boyutlu render açıkça etiketli aksonlar (Film 1) ile ilgili bu hücrelerin yerini gösterdi. Nakledilen hücrelerin görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir başka yaklaşım başlangıçta tek hücreli sarısı içine Alexa 594 gibi bir floresan hücre boya, microinject yabani türü veya GFP transgenik embriyo düzenledi. Bir örnek olarak tek hücreli aşamada, içine Alexa 594 vahşi tip embriyolar enjekte edilir. Biz onlara kalkan aşamalı gastrula geliştirmek için izin verilen ve daha sonra yukarıda da belirtildiği gibi önbeyin hedef nakli yapılan, ancak bunun yerine transgenik konak gastrula tg [GFAP: nük-GFP] naklediliyor . Lazer Tarama mikroskopisi dorsal telencephalon Görüntüleme GFP arasında donör hücreleri floresan kırmızı kümeler + ön beyin içindeki çekirdekleri (Şekil 2B) saptandı. Biz daha Lazer Tarama Konfokal ile iki saat boyunca Z-yığınlar her üç dakikada toplayarak bu konak analiz. Volocity yazılım (Doğaçlama) kullanarak bu timelapse 4-boyutlu render rodamin hücre zarları dinamik hücresel hareketler gösterirnd GFP + çekirdek (Movie 2). Şekil 1'de bir büyük halini görmek için tıklayınız. Şekil 1: deneysel yöntemler Nakli cihaz ve şematik. A) Apparatus gastrula aşamalı nakli yapmak için kullanılır. Zeiss Lumar floresan stereo mikroskop bu nakli yapmak için kullanılmıştır. Joystick kontrollü odak ve zoom (kırmızı daire solda). TransferMan NK Joystick kontrollü (sağda kırmızı daire) olan kılcal pozisyonu işlemek için kullanılmıştır. Kurulum sırasında 60-80 embriyolar, daha önce bir plastik kalıp (mor ana hatlarıyla kutu) ile 100mm bir petri yapılan bireysel agar kuyu içine yerleştirilir. Eppendorf tarafından üretilen kılcal nakli (TransferTip) 15μm iç çapı açılması ve 20 derece açılı ucu (yeşil ana hatlarıyla kutu) vardır. Hücre aspirasyon Eppendorf AirTram (kırmızı ana hatlarıyla kutu) ile kontrol edilir. B) ana embriyolara donörden gastrula sahne nakli prosedürünün İllüstrasyon. Embriyolar (burada görüldüğü gibi) veya Alexa 594 enjekte donör embriyolar (protokol açıklanan): Hücreler tg [GFP GFAP] elde edilir. Hücreler yarım kalkan ve hayvan kutup arasındaki orta hat kaldırıldı ve ana embriyoların aynı bölgeye nakledilmektedir. Konaklar sabit ve Konfokal Mikroskop Tarama Lazer kullanılarak görüntülenmiş. Şekil 2'de büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. Zebrafish Önbeynin gastrula sahne nakli Örnek A) nakledilen tg [GFAP: GFP] vahşi tip ana embriyoların önden görünümü. Zebrafish önbeyin diencephalons ve telencephalon hücreler. Aksonlar kırmızı etiketli (α-Asetillendirilmiş tubulin antikor) ve nakledilen hücrelerin yeşil (endojen GFP ifade) olarak etiketlenir. Embriyolar 30 hpf. Ankastre gösterir GFP + hücreler radyal glial morfolojisi. Rodamin floresanlama nakledilen hücrelerin (kırmızı) ile ev sahibi embriyo: canlı tg [nük-GFP GFAP] telencephalon B) Dorsal görünümü. Ev sahibi embriyoların Çekirdekler yeşil (GFP) etiketlenir. Kesikli çizgi önbeyin ön yüzeyi özetliyor. Düz çizgi, ventriküler dilimini gösterir. Ölçek çubuğu 10μm. Movie 1. Önbeyin commissures arasından ektopik etiketli radyal glial hücreler arasındaki ilişki bir gastrula hücreler sahnelenen tg [GFAP: GFP] embriyo GFP transgenik olmayan bir vahşi tip hattına naklediliyor. Lazer Tarama Konfokal Z-Yığın Volocity yazılımı kullanarak 3 boyutlu render için toplanan ve sonra işlendi. Başlangıçta, görüntü 30hpf zebrafish önbeyin bir ön görünümü ve yatay olarak Şekil 2B ile karşılaştırıldığında çevrildiğinden. Aksonlar ön komissür (AC, üst) ve post-optik komissür (POC, alt) içinde (bir Asetillendirilmiş tubulin, kırmızı) görülür. Yeşil hücreler, GFP + nakledilen hücrelerin önbeyin ve oluşturulan açık radyal glial morfolojisi kök saldı. Film ilerledikçe POC temas sonunda ücret sahip iki radyal glial hücreler üzerinde odaklanmaktadır. Movie 1 indirmek için buraya tıklayın. Movie 2. Önbeyin nakledilen Alexa 594 Etiketli Hücreler Timelapse görüntüleme tg Alexa 594 ile enjekte gastrula hücreler naklediliyor. [GFAP: nük-GFP] transgenik embriyolar. Bu film, Z-yığınlar her 5 dakikada alındığı bir 2s timeseries bir 3-D projeksiyon temsil eder. Z-Yığınları konfokal mikroskop bir lazer tarama toplanan ve 4-D kaplamalar Volocity yazılım kullanılarak tamamlanmıştır. Nakledilen hücrelerin Alexa 594 (kırmızı) etiketli ve GFP + çekirdekleri yeşil. Bu timelapse çalışır gibi, 4D görüntü 30hpf az önbeyin bir sırt görünümü ile başlar net hareketi tüm nakledilen hücrelerin hücre membranlar GFP tespit edilir gibi, X ekseni hakkında döndürmek olacak + çekirdekleri de. tıklayınız Film 2 Download.