Deel 1: Alexa 594 Labeled embryo's 1,1 micro-injectie Plate en Needle voorbereiding Het maken van micro-injectie platen Bereid injectie bestaat uit platen van drie tot vijf een-mm dalen binnen een agarose mal met behulp van een techniek Westerfield, 2007 1. Deze bakken zullen snuggly houdt de embryo's in een lijn voor een efficiënte en systematische micro-injecties. Voorafgaand aan het maken van de borden, neem drie 1-mm, 4-inch lange non-filament capillairen en zorgvuldig te breken in de helft. Met behulp van superlijm, lijm twee van deze 2-inch lange capillairen side-by-side op een vlakke ondergrond. Lijm de derde capillair op de top van deze twee, genesteld in het bos, het creëren van een piramide vorm met de drie haarvaten. Laten drogen en totdat er genoeg "via mallen" zijn gebouwd herhalen. Giet 20-25ml (5mm diepte) van gesmolten 1,5% agarose in embryo medium (EM) [5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0,33 mm CaCl2, 0,33 mm MgSO 4 en 0,00003% methyleenblauw] in een 100mm petrischaal. Onmiddellijk plaats drie tot vijf van de eerder gemaakte piramidevormige via mallen tot op de bodem van de plaat zorgen voor de platte kant van de mal is contact met de bodem van de petrischaal en volledig bedekt door agarose. Wanneer de agarose gestold is, moet het glas capillair mallen worden genomen. Om te verwijderen, knippen een groot agarose plein met de drie capillaire mallen. Voorzichtig los van de agar aan de rand van de snede plein en gooi deze weg. Flip de vierkante agar stuk over en met behulp van fijne tang, volledig verwijderen van de trog mallen. Giet gesmolten agarose in de petrischaal rond het plein aan de nieuw gevormde putten zijn plaats te houden. Laat set. Platen kunnen worden parafilm verzegeld en opgeslagen voor weken bij 4 ° C. Gooi op tekenen van een groei in de agar. Naalden voor micro-injecties. Gebruik een micropipet capillair trekker de nodige injectienaalden van 1 mm, 4-inch glazen capillairen met interne gloeidraad. Naalden werden getrokken met behulp van de Flamming / Bruin micropipet Puller met een hitte van 550, trekkracht van 120, snelheid van 200, en een tijd / vertraging van 200. 1.2 embryoteams en micro-injectie Apparatuur Setup Bevruchte eieren worden onmiddellijk verzameld nadat ze zijn gelegd en onderhouden in een petrischaal gevuld met EM. Injectie van fluorescerende dextranen is ideaal bij het een-cellig stadium en moet worden ingevuld door de 16-cellig stadium 2. Met behulp van een brede tip glazen pipet, te verdrijven embryo's in de putjes van een kamertemperatuur injectie plaat gevuld met EM. Voorzichtig wig van de embryo's in de bodem van de goten met gevouwen stomp pincet. Embryo's die chorion of eigeel zijn gedrang komt, moet worden weggegooid. Laad de injectienaald met een-2μl van de verwaterde fluorescerende Alexa 594-oplossing (5% van het gewicht in 0,2 M KCl). Laat de dextran te reizen naar de punt van de injectienaald door capillaire werking als gevolg van de ingesloten filament het uitvoeren van de lengte van de injectienaald. Bevestig de injectienaald op de capillaire houder van een stereotactische micromanipulator. Stel de druk op de microinjector apparaat om te beginnen met 40-50 Psi en de pulsduur van 500msec. Voorzichtig grazen de punt van de injectienaald om de zegel te verbreken met een pincet (ideaal diameter is 0.05-0.15mm). Met behulp van een steromicroscope, verdrijven de dextran op een micrometer met minerale olie op de hoogte van het aan de naald te kalibreren. Wijzig de bolus grootte door het aanpassen van de luchtdruk, de duur van de puls en de grootte van de naaldpunt. Een bolus grootte gelijk aan een volume van 0,8-1nl moet worden gehandhaafd door injecties 3. Vaak tips verstopt raken met deeltjes dooier, het aanpassen van de druk of het breken van de naald kan het probleem te verminderen, anders een nieuwe injectie naald moet worden geladen. 1,3 micro-injecties van de TL-Alexa 594 Onder hoge vergroting, vanaf het ene uiteinde van de trog, soepel doorboren de chorion en de celmembraan van embryo's tot het aangaan van de dooier. Injecteer de oplossing dextran net onder de cel. Zorg ervoor dat de injectienaald te verwijderen met dezelfde vloeiende beweging gebruikt om het embryo in te voeren. Verplaats de petrischaaltje de volgende embryo inline positie en het injecteren van de lengte van de trog voort te zetten. Controleer regelmatig de druk en de bolus grootte. Wees voorzichtig niet te verplaatsen of te buigen de injectie naald als deze zich in het embryo als dit waarschijnlijk fataal schade aan de embryo en / of de injectienaald breken. Duw de embryo's uit de bakken met een tang. Overbrengen naar een petrischaal gevuld met antibiotica Pen / Step EM, zoals beschreven in Nusslein-Volhard en Dahm (2002) (1 ml 6.5M CaCl2, 1 ml 3,5 M NaHCO 3, 25 ml 20x EM en 10 ml 60mg/ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine stock) in voorbereiding voor later transplantaties. Incubeer de embryo's bij 28,5 ° C en monitor voor onbevruchte eieren of embryo dood. Deel 2: gastrulastadium Transplantaties 2.1 Dechorionating en Transplant Plate voorbereiding Dechorionating platen. Dechorionated embryo's die niet hebben voltooid epiboly vereisen een zachte bodemplaat, zodat er geen te hebben hun dooier houden en scheuren op de plastic.The dagen voorafgaand aan de transplantatie, met behulp van de 1,5% agarose-oplossing eerder beschreven, maken dechorionating platen door het gieten van 5 10 ml van gesmolten agarose in een 100mm petrischaal. Slechts een dunne laag van agarose (2-3mm) is nodig om de embryo's kussen tijdens dechorination. Laat afkoelen. Transplant platen. Specialized platen met gescheiden putten moeten worden gemaakt, zoals beschreven in 4. Giet 30 ml van de 1,5% agarose oplossing in een 100 mm petrischaal en plaats een transplantatie goed mal. De mal moet bevatten 104 driehoekige divots elk bestaande uit drie zijden 90 graden en een 45 graden schuine kant. De putten zijn ontworpen om twee embryo's side-by-side (Fig. 1A, paarse doos) vast te houden. Zorg ervoor dat u luchtbellen val onder de mal. Laat de agarose uitharden. Het verwijderen van de mal onthult een verzonken gebied met het plein putten met een schuine rand. 2.2 embryo's en Transplant Apparatuur Setup Positionering van de donor en gastheer embryo's Ontwikkeling van hosts en donoren moeten worden gecontroleerd om te behouden in de buurt van leeftijd-gematchte paren. Om dit te doen, kunnen embryo's ter sprake komt op verschillende temperaturen (25-31 ° C) te vertragen of versnellen ontwikkeling respectievelijk. Zowel de gastheer en donor embryo's de hand dechorionated op een agar-gecoate dechorionating plaat 1 uur voor de gewenste leeftijd In het geval van gastrulastadium transplantaties dit zou moeten worden aangevuld met 5hpf worden. Voorafgaand aan de stage schild, bij 5.5hpf gastheer en donor embryo's worden geladen in een transplantatie bord vol met antibiotica EM. Embryo's worden geladen in de individuele 1-mm putten met een glazen pipet. Een voorbeeld hiervan is als volgt: de eerste rij wordt gevuld met donor embryo's (18 in totaal, twee embryo's per well) en de volgende twee rijen zijn gevuld met gastheer embryo's (een embryo per goed, 9 embryo's per rij). Het opzetten van de transplantatie apparaat Transplantaties worden uitgevoerd op de Zeiss Lumar fluorescerende stereo microscoop dat volledig geautomatiseerd, op afstand bediende zoom en focus manipulatie heeft. Terwijl de transplantaties kan worden gedaan zonder dat de automatisering van de microscoop het doet drastisch te verhogen gemak en de efficiency in het bijzonder wanneer een groot aantal transplantaties is gewenst. Stel de Eppendorf Airtram naar het midden locatie van zijn schaal. Sluit de Airtram (Fig. 1A, rode box) slang aan op de capillaire houder, en zet de houder aan het Eppendorf geautomatiseerde micromanipulator (Fig. 1A). Dit micromanipulator is volledig geautomatiseerd en op afstand bediende. Nogmaals, deze automatisering is niet geheel noodzakelijk, maar verbetert zijn dat men de naald navigeren en in het embryo. U kunt ook veel onderzoekers de voorkeur aan de OilTram dat wordt gezegd dat soepelere controle van de cel collectie te bieden, maar we hebben geen problemen met de Airtram. De haarvaten gebruikte waren steriele Eppendorf TransferTips (ES) die een 15 m afgeschuind opening aan het uiteinde en een 20 graden gebogen hoek van 1 mm van het uiteinde (Fig. 1A groene doos). 2.3 gastrulastadium Cel Transplantatie Op 6hpf, met behulp van de micromanipulator voorzichtig grazen het embryo met de punt van de capillaire voor het embryo draaien in positie voor mobiele extracties zodanig dat de middellijn en het schild zichtbaar zijn en tegen de punt van het capillair. Aspireren een kleine hoeveelheid van EM in de capillaire om enige kans van cellen contact met de lucht-water interface, die zou beschadigen de cellen te voorkomen. Op basis van de zebravis lot kaart, gericht op cellen aan de voorhersenen vereist dat de transplantatie van cellen op de middellijn precies tussen het dier paal en het schild 5. Voorzichtig doorboren het ectoderm van de donor embryo's (Rhodamine geïnjecteerd of GFP transgene embryo's) in deze locatie. De dikte van de cellen tussen het ectoderm en de onderliggende dooier in het gastrula is dun, daarom voorzichtig te zijn niet naar de dooier doorboren, omdat dit zal vaak tot de dood leiden binnen enkele uren. Met behulp van de Airtram aspireer cellen langzaam in de capillair. Altijd onderhouden zichtbaarheid van de waterlijn. Een lichte beweging van de tip, terwijl in de donor zal helpen om cel-cel contacten verliezen. Ongeveer 10 tot 50 cellen van de donor embryo moet worden gehaald voordat het wordt verwijderd uit het embryo. Verwijder het capillair van de donor, net oriënteren de gastheer, en Pierce en verdrijven de cellen in de juiste same locatie tussen het dier paal en het schild van de gastheer embryo's. Na transplantatie, zijn de donor en gastheer embryo's verwijderd uit de putten, gescheiden en voorzichtig op een agar gecoate petrischaal gevuld met antibiotica EM. Het verlaten van embryo's in de transplantatie putten verhoogt sterfte. Incubeer embryo's bij 28,5 ° C. 2.4 Het visualiseren en Imaging embryo's Montage vaste en levende embryo's. Host embryo's van transgene GFP of Rhodamine geïnjecteerde embryo's kunnen worden gevisualiseerd en afgebeeld in leven of als vaste embryo's. We presenteren hier voorbeelden van zowel vaste als live-imaging opties. Fix embryo's werden opgeofferd op 30hpf met behulp van 4% paraformadehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) overnacht bij 4 C 1. Spoel embryo's 2x en dan 3 x 5 minuten wassen in 0,1 PB. In het voorbeeld dat we geven, zijn vaste gastheren immunolabeled voor alle axonen met antilichamen gericht tegen Geacetyleerd Tubuline (α-AT) zoals eerder is beschreven 6. Plaats embryo's in 75% glycerol, wastafel bij kamertemperatuur en daarna bewaren bij 4 ° C. Bereid een dia twee embryo's te monteren. Maak twee vaseline vierkante schetst op een dia die de binnenkant vorm en diameter van een vierkante dekglaasje wedstrijd. Deyolk een embryo en voor een vooraanzicht van de voorhersenen, ontleden uit de voorhersenen door te snijden loodrecht in de middenhersenen. Plaats dit weefsel met een minimale hoeveelheid van glycerol in de aardolie goed. Orient het weefsel in de juiste positie en plaats een dekglaasje op het monster. Levend specimen werden gemonteerd in een 0,75% agarose-oplossing bestaat in een 4% oplossing van tricaïne (in EM) op glazen bodem cultuur gerechten. Voorafgaand aan de agarose verstevigen, is het embryo gemanipuleerd met een wolfraam naald correct te oriënteren voor de beeldvorming. Voor onze analyse hebben we gericht de voorhersenen direct tegen de dekglaasje aan. Imaging Zowel vaste en live gastheren werden afgebeeld met behulp van de Leica SP5 Laser scanning confocale microscoop. Z-Stacks werden verworven en 3 – of 4-dimensionale beeldverwerking werd voltooid met behulp van Volocity software. Resultaten: In een poging om de rol van astroglial cellen adres in de voorhersenen is het noodzakelijk om zowel visualiseren deze cellen en doel verschillende genetische manipulaties aan kleine clusters van diencephalic en telencephalic cellen. Voor het opwekken van deze soorten van chimère embryo's, waarbij een gedeelte van het astroglial bevolking in het embryo is anders dan al door genotype of fenotype, hebben we een veelzijdige aanpak die het gebruik van GFP transgene embryo's, die astroglia labels combinatie gebruikt, met het gebruik van gastrula -geënsceneerde stamceltransplantatie. Om specifiek onze klonen te richten op het diencephalon, we gebruik gemaakt van de zebravis gastrula lot kaart om selectief te extraheren cellen op de middenlijn op gelijke afstand van het dier paal en het schild 5 (Fig. 1B). Deze gewonnen tg [GFAP: GFP] cellen werden vervolgens getransplanteerd in dezelfde locatie in een wild-type gastheer gastrula, die vervolgens werd verhoogd tot 30hpf, en immunolabeled voor alle axonen (α-Geacetyleerd Tubuline) als referentie oriëntatiepunten voor de voorhersenen anatomie. Als voorbeeld hier getoond, confocale beeldvorming van een gastheer embryo onthult geïsoleerde GFP + cellen in het telencephalon en diencephalon (Fig. 2A). De volledige morfologie van deze GFP + cellen kunnen worden waargenomen in deze klonale test, waaruit blijkt dat de meeste van deze cellen nemen op de karakteristieke radiale gliale morfologie, waar de soma is gelegen naast de ventriculaire zone en een brede uiteinde voet eindigt een radiale proces op pial oppervlak (Fig. 2A, inzet). Drie-dimensionale weergave van de Z-stack van deze verzamelde optische schijfjes duidelijk de positie van deze cellen met betrekking tot de gelabelde axonen (Film 1). Een andere benadering vaak gebruikt voor het visualiseren van getransplanteerde cellen is een cellijn fluorescerende kleurstof, zoals Alexa 594, aanvankelijk microinject in de dooier van een een-cel geënsceneerd wild type of GFP transgene embryo. Als voorbeeld nemen we geïnjecteerd Alexa 594 in wild type embryo's in het een-cellig stadium. We konden ze zich ontwikkelen tot schild-stage gastrula en vervolgens uitgevoerd voorhersenen gericht transplantatie zoals hierboven genoemd, maar in plaats daarvan hebben we getransplanteerd in tg [GFAP: nuc-GFP] transgene gastheer gastrula. Beeldvorming van de dorsale telencephalon door Laser scanning confocale microscopie is gebleken fluorescerende rode clusters van donor cellen onder de GFP + kernen binnen de voorhersenen (Fig. 2B). We hebben verder geanalyseerd deze host door het verzamelen van Z-stacks om de drie minuten in de loop van twee uur met de laser scanning confocale. 4-dimensionale weergave van deze timelapse gebruik Volocity software (Improvisation) toont dynamische cellulaire bewegingen van de rhodamine celmembranen eennd de GFP + kernen (Film 2). Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien. Figuur 1: Transplant apparatuur en schematische van experimentele methoden. A) apparatuur die wordt gebruikt om gastrula-stage transplantaties uit te voeren. De Zeiss Lumar fluorescerende stereo microscoop werd gebruikt om deze transplantaties verrichten. Het is op afstand bediende focus en zoom (links rode cirkel). De Transferman NK werd gebruikt om de positie van de capillaire die ook op afstand bediende (rechts rode cirkel) te manipuleren. Tijdens het instellen 60-80 embryo's worden geplaatst in afzonderlijke agar putten eerder in een 100mm petrischaal met een plastic mal (paars geschetste kader). De transplantatie capillair (TransferTip) vervaardigd door eppendorf heeft een 15μm binnendiameter opening en een 20 graden schuine punt (groen geschetste kader). Het streven van de cellen wordt geregeld met Eppendorf's Airtram (rood geschetste kader). B) Illustratie van gastrulastadium transplantatie procedure, van de donor in de gastheer embryo's. Cellen worden gewonnen uit tg [GFAP: GFP] embryo's (hier afgebeeld) of Alexa 594 geïnjecteerd (zoals beschreven in protocol) donor embryo's. Cellen worden verwijderd uit de middellijn halverwege het schild en dier paal, en getransplanteerd in dezelfde regio van de gastheer embryo's. Hosts zijn vast en beeld gebracht met behulp van Laser Scanning confocale microscopie. Klik hier om een grotere versie van figuur 2 te zien. Figuur 2. Voorbeeld van gastrulastadium transplantaties binnen de zebravis voorhersenen A) een vooraanzicht van wild-type gastheer embryo's met getransplanteerde tg [GFAP: GFP]. Cellen in de diencephalons en telencephalon van de zebravis voorhersenen. Axonen worden gelabeld in het rood (α-tubuline antilichaam Geacetyleerd) en de getransplanteerde cellen worden gelabeld in het groen (endogene GFP expressie). Embryo's zijn 30 hpf. Inzet toont radiale gliale morfologie van GFP + cellen. B) dorsaal aanzicht van de telencephalon van een live tg [GFAP: nuc-GFP] gastheer embryo met Rhodamine fluorescerende getransplanteerde cellen (rood). Kernen van gastheer embryo's worden gelabeld in het groen (GFP). Onderbroken lijn schetst de voorste oppervlak van de voorhersenen. Solide lijn geeft de ventriculaire zone. Schaal bar is 10μm. Film 1. . De relatie van ectopisch gelabelde radiale gliacellen onder voorhersenen commissuren Cellen van een gastrula geënsceneerde tg [GFAP: GFP] embryo werden getransplanteerd in een niet-GFP transgene wild-type lijn. Een laser scanning confocale Z-Stack werd verzameld en vervolgens verwerkt voor 3-D-rendering gebruiken Volocity software. In eerste instantie, het beeld is een vooraanzicht van de zebravis voorhersenen bij 30hpf, en het is horizontaal gespiegeld ten opzichte van 2B figuur. Axonen (een-Geacetyleerd tubuline, rood) in de voorste commissuur (AC, boven) en post-optische commissuur (POC, onder) worden gezien. De groene cellen zijn de GFP + getransplanteerde cellen die wortel schoot in de voorhersenen en de gegenereerde duidelijke radiale glia-morfologie. Naarmate de film vordert richt het zich in op twee radiale gliale cellen bezitten einde honorarium dat de POC contact. Klik hier om een film downloaden. Movie 2. Timelapse beeldvorming van getransplanteerde Alexa 594 gelabelde cellen in de voorhersenen Cellen van een gastrula eerder geïnjecteerd met Alexa 594 werden getransplanteerd naar tg. [GFAP: nuc-GFP] transgene embryo's. Deze film is een 3-D projectie van een 2h tijdreeks, waarin Z-stacks werden genomen om de 5 minuten. Z-Stacks werden verzameld op een laser scanning confocale microscoop, en 4-D renderings ingevuld met behulp Volocity software. Getransplanteerde cellen zijn gelabeld met Alexa 594 (rood), en het GFP + kernen zijn groen. Aangezien dit timelapse loopt, de 4D afbeelding begint met een dorsaal aanzicht van de voorhersenen bij 30hpf en draait over de X-as, zo duidelijk beweging in de celmembranen van alle getransplanteerde cellen en in de GFP + kernen ook. Klik hier Downloaden Movie 2.
