Parte 1: Alexa 594 embriones con etiqueta 1.1 microinyección Plate y preparación de la aguja Hacer las placas de microinyección Preparar las placas de inyección compuesto de tres a cinco canales de 1 mm en un molde de agarosa utilizando una técnica de Westerfield, 2007 1. Estos canales snuggly celebrará los embriones en una línea de microinyecciones eficiente y sistemática. Antes de hacer los platos, tomar tres de 1 mm, de 4 pulgadas de largo capilares no filamento y el cuidado a romper por la mitad. Utilizando pegamento, cola de dos de estos 2 pulgadas de largo capilares de lado a lado en una superficie plana. Pegue el tercero capilar en la parte superior de estos dos, ubicado en el bosque, creando una forma de pirámide con tres de los capilares. Deje secar y repita hasta que suficientes "moldes de canal" se construyen. Verter 20-25 ml (5 mm de profundidad) de 1,5% de agarosa fundida en un medio de embrión (EM) [5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mm de CaCl2, 0,33 mm MgSO4 y 0,00003% de metileno blue] 100 mm en una placa de Petri. Immediately place tres a cinco de los moldes a través anteriores en forma de pirámide en la parte inferior de la placa de velar por la parte plana del molde está tocando la parte inferior de la placa de Petri y completamente cubierto por la agarosa. Cuando la agarosa se ha solidificado, el molde capilar de vidrio deben ser retirados. Para eliminar, cortar un cuadrado grande de agarosa que contiene los tres moldes capilar. Suavemente desalojar el agar en la periferia de la plaza de cortar y desechar. Voltear la pieza de agar cuadrados más y, usando unas pinzas finas, eliminar por completo los moldes de canal. Vierta la agarosa fundida en la placa de Petri en la plaza para mantener los pozos recién moldeado en el lugar. Deje reposar. Las placas pueden parafina sellados y almacenados durante semanas a 4 ° C. Descartar a los signos de cualquier crecimiento en el agar. Agujas para microinyecciones. Utilice un extractor de micropipeta capilar que las agujas de inyección necesaria de 1 mm, los capilares de 4 pulgadas de vidrio con filamento interno. Las agujas se retiraron con el Flamming / Extractor Brown micropipeta con un calor de 550, fuerza de tracción de 120, velocidad de 200, y un tiempo / demora de 200. 1.2 de recogida de embriones y la instalación de aparatos de microinyección Los huevos fertilizados son recogidos inmediatamente después de haber sido establecido y mantenido en una placa de Petri llena de EM. La inyección de fluorescentes dextranos es ideal en el estadio de una célula y debe ser completado por la etapa de 16 células 2. Con una pipeta punta de vidrio de ancho, expulsar a los embriones en los pocillos de una placa de sala de inyección de temperatura llena de EM. Cuña suavemente los embriones en la parte inferior de los senos con pinzas juntas contundente. Embriones cuyo corion o yema de haber estado en peligro debe ser desechada. La carga de la aguja de la inyección con 1-2μl de diluirse fluorescente Alexa 594 solución (5% en peso de 0,2 M KCl). Deje que el dextrano para viajar a la punta de la aguja de la inyección por la acción capilar, debido a que el filamento integrado que funciona la longitud de la aguja de inyección. Coloque la aguja de la inyección al titular de la capilaridad de un micromanipulador estereotáctica. Ajuste la presión sobre el aparato microinyector para comenzar con 40-50 Psi y duración de pulso de 500 mseg. Suavemente pastar la punta de la aguja de inyección para romper el sello con fórceps (diámetro ideal es de 0,05-0.15mm). El uso de un steromicroscope, expulsar al dextrano en un micrómetro con aceite mineral encima de él para calibrar la aguja. Modificar el tamaño del bolo mediante el ajuste de la presión del aire, la duración del pulso y el tamaño de la punta de la aguja. Un tamaño de bolo equivalente a un volumen de 0,8 1NL debe mantenerse a lo largo de tres inyecciones. A menudo consejos se taparán con las partículas de yema, el ajuste de la presión o la rotura de la punta de la aguja puede aliviar el problema, de lo contrario una aguja nueva debe ser cargada. 1.3 microinyecciones de fluorescente Alexa 594 En gran aumento, a partir de un extremo de la cubeta, sin problemas perforar el corion y la membrana celular de los embriones para entrar en la yema. Se inyecta la solución de dextrano justo debajo de la célula. Asegúrese de retirar la aguja de la inyección con el mismo movimiento suave utilizado para entrar en el embrión. Mover la placa de Petri para la posición de la línea de embriones siguiente y seguir inyectando a lo largo del canal. Controlar la presión y el tamaño del bolo periódicamente. Tenga cuidado de no mover o doblar la aguja cuando se encuentra en el embrión, ya que es probable que el daño fatalmente el embrión y / o romper la aguja de inyección. Empuje suavemente los embriones de los valles con unas pinzas. Transferirlos a una placa de Petri llena de pluma antibiótico / Paso EM como se describe en Nüsslein-Volhard y Dahm (2002) (1 ml de 6,5 millones de CaCl 2, 1 ml de 3,5 M NaHCO 3, 25 ml y 10 ml de 20x EM de 60mg/ml la penicilina, 100 mg / ml estreptomicina stock) en la preparación de los trasplantes más tarde. Incubar los embriones a 28,5 ° C y el monitor de huevos no fertilizados o la muerte del embrión. Parte 2: Trasplantes gástrula 2.1 Dechorionating y preparación Plate trasplante Dechorionating placas. Dechorionated embriones que no han completado epibolia requiere una placa de fondo suave, para no tener su yema de adherirse y lágrimas el día en plastico antes de trasplantes, con el 1,5% de solución de agarosa se ha descrito anteriormente, hacer las placas dechorionating vertiendo 5 -10 ml de agarosa fundida en una placa de Petri de 100 mm. Sólo una fina capa de agarosa (2-3mm) es necesario para amortiguar los embriones durante dechorination. Deje que se enfríe. Placas de trasplante. Platos especializados en pozos separados deben hacerse como se describe en 4. Verter 30 ml de la solución de agarosa al 1,5% en una placa de Petri de 100 mm e insertar un trasplante y el moho. El molde debe contener 104 divots triangular cada uno compuesto de tres partes 90 grados y uno de los lados en ángulo de 45 grados. Los pozos están diseñados para mantener dos embriones de lado a lado (Fig. 1A, cuadro morado). Tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire bajo el molde. Deje que el endurecer de agarosa. Extracción del molde revela un área hundida que contienen los pozos cuadrados, con un borde inclinado. 2.2 Configuración de embriones y aparatos de Trasplantes Colocación de los embriones de donantes y de acogida El desarrollo de los ejércitos y los donantes deben ser monitoreados para mantener cerca de la misma edad emparejamientos. Para ello, los embriones se pueden presentar en diferentes temperaturas (25-31 ° C) para ralentizar o acelerar el desarrollo, respectivamente. Host y embriones de donantes debe ser parte dechorionated en un agar con cubierta placa dechorionating 1 hora antes de la edad deseada En el caso de los trasplantes de fase de gástrula esto tendría que ser completado por 5hpf. Antes de proteger el escenario, en el host 5.5hpf y embriones de donantes se cargan en un plato lleno de trasplante de EM con antibióticos. Los embriones se cargan en la persona de 1 mm de pozos con una pipeta de vidrio. Un ejemplo es el siguiente: la primera fila está llena de embriones de donantes (18 en total, dos embriones por pocillo) y los dos siguientes filas están llenas de embriones de acogida (un embrión por tanto, nueve embriones por fila). Configuración del aparato de trasplante Los trasplantes se llevan a cabo en el microscopio Zeiss Lumar estéreo fluorescente que tiene totalmente automatizado, zoom joystick de control y manipulación de enfoque. Mientras que los trasplantes se puede hacer sin esta automatización del microscopio que hace aumentar considerablemente la facilidad y la eficiencia, especialmente cuando un gran número de trasplantes que se desea. Establecer el Airtram Eppendorf a la ubicación medio de su escala. Conecte el Airtram (Fig. 1A, cuadro rojo) la tubería a la titular de capilares, y asegurar el soporte para el micromanipulador Eppendorf automatizado (Fig. 1A). Este micromanipulador es totalmente automatizado y controlado por joystick. Una vez más, esta automatización no es del todo necesario, pero mejora significativamente la capacidad de los de navegar alrededor de la aguja y en el embrión. Por otra parte, muchos investigadores prefieren el OilTram que se dice para ofrecer un control más suave de la recogida de células, sin embargo, no hemos tenido dificultades con el Airtram. Los capilares utilizados fueron estériles TransferTips Eppendorf (ES) que tienen un bisel de 15 m de abertura en la punta y una inclinación de 20 grados de ángulo de 1 mm de la punta (Fig. 1A caja verde). 2.3 Gástrula Trasplantes Etapa Celular En 6hpf, utilizando el micromanipulador suavemente pastar el embrión con la punta del capilar para hacer girar el embrión en la posición para la extracción de células de tal manera que su línea media y el escudo son visibles y se oponen a la punta del capilar. Aspirar una pequeña cantidad de EM en el capilar para prevenir cualquier posibilidad de contacto con las células de la interfase aire-agua, que podría dañar las células. Basado en el mapa del destino de pez cebra, atacar a las células en el cerebro anterior requiere el trasplante de células en la línea media exactamente entre el polo animal y el escudo 5. Suavemente perforar el ectodermo de embriones de donantes (inyectada rodamina o embriones transgénico GFP) en esta ubicación. El espesor de las células entre el ectodermo y la yema subyacente en la gástrula es delgado, por lo tanto, tenga cuidado de no atravesar la yema de huevo, ya que a menudo conducen a la muerte en cuestión de horas. Utilizando las células aspirado Airtram lentamente en el capilar. Siempre mantener la visibilidad de la línea de agua. Una ligera agitación de la punta, mientras que en el donante le ayudará a perder contactos célula-célula. Aproximadamente 10 a 50 células de los embriones de los donantes debe ser extraído antes de que sea removido del embrión. Retire el capilar del donante, del mismo modo anfitrión Oriente, y Pierce y expulsar a las células en el exacto SAme ubicación entre el polo animal y el escudo de los embriones de acogida. Después del trasplante, los embriones de donantes y de acogida se eliminan de los pozos, se separan y se coloca suavemente sobre un plato de agar recubierto de Petri llenas de EM con antibióticos. Dejando de embriones en los pozos de trasplantes aumenta la mortalidad. Embriones se incuban a 28,5 ° C. 2.4 Visualización de imágenes y embriones De montaje fijo y embriones vivos. Embriones de acogida derivados de transgénicos GFP o embriones rodamina inyectado se pueden visualizar imágenes y embriones vivos, o fijos. Presentamos aquí ejemplos de las dos opciones con imágenes fijas como en vivo. Fix embriones fueron sacrificados a 30hpf utilizando el 4% paraformadehyde en 0,1 M de tampón fosfato (PB) durante la noche a 4 ° C 1. Enjuague embriones 2x y lavar 3 x 5 minutos en 0,1 M PB. En el ejemplo que ofrecemos, los ejércitos se fija immunolabeled para todos los axones con anticuerpos dirigidos contra tubulina acetilada (α-AT) como se describió anteriormente 6. Embriones lugar en el 75% de glicerol, un lavabo a temperatura ambiente y después se almacenan a 4 ° C. Prepare una diapositiva para montar dos embriones. Cree dos vaselina cuadrados resume en una diapositiva que coincida con la forma en el interior y el diámetro de un cubreobjetos cuadrado. Deyolk un embrión, y para obtener una vista frontal del cerebro anterior, la disección de cerebro anterior por el corte perpendicular por el cerebro medio. Colocar este tejido con una mínima cantidad de glicerol en el petróleo también. Orientar a los tejidos en la posición adecuada y colocar un cubreobjetos sobre la muestra. Espécimen vivo se montaron en un 0,75%, solución de agarosa confeccionados con una solución al 4% de tricaína (EM) en placas de cultivo de fondo de cristal. Antes de la solidificación de la agarosa, el embrión se manipula con una aguja de tungsteno para orientar correctamente la imagen. Para nuestro análisis hemos orientado el cerebro anterior directamente contra el cubreobjetos. Imágenes Ambas máquinas fijas y en vivo fueron estudiados utilizando el Leica SP5 láser del microscopio confocal de barrido. Z-Las pilas se han adquirido y 3 – o 4-dimensional de procesamiento de imágenes se completó con el software Volocity. Resultados: En un esfuerzo por abordar el papel de las células en el cerebro anterior astroglial es necesario tanto para visualizar estas células y el destino genético diferentes manipulaciones a pequeños grupos de células diencefálico y telencefálicas. Para generar este tipo de embriones quiméricos, en la que una parte de la población astroglial en el embrión es diferente ya sea por genotipo o fenotipo, que utiliza un enfoque multifacético que combina el uso de GFP embriones transgénicos, que las etiquetas astroglía, con el uso de gástrula -organizó el transplante de células. Para dirigidas específicamente a los clones de diencéfalo, se utilizó el mapa de pez cebra gástrula destino para extraer selectivamente las células en la línea media equidistante de los polos de los animales y el escudo 5 (Fig. 1B). Estos extraen tg [GFA: GFP] Las células fueron trasplantadas en la misma ubicación en una de tipo salvaje anfitrión gástrula, que se planteó entonces 30hpf y immunolabeled para todos los axones (α-tubulina acetilada) como hitos de referencia para la anatomía del cerebro anterior. A modo de ejemplo se muestra aquí, la imagen confocal del embrión huésped una muestra aislada GFP + células de todo el telencéfalo y el diencéfalo (Fig. 2A). La morfología completa de estas buenas prácticas agrarias + células pueden ser observadas en este ensayo clonal, que revela que la mayor parte de estas células adquieren la característica morfología radial gliales, donde se encuentra el soma adyacente a la zona ventricular y un pie extremo grande termina un proceso radial en el superficie pial (Fig. 2A, recuadro). Representación tridimensional de la Z-stack de estos cortes ópticos recogidos muestran claramente la posición de estas células con respecto al etiquetado de los axones (Película 1). Otro método comúnmente utilizado para la visualización de las células trasplantadas es microinject inicialmente un tinte de estirpe de células fluorescentes, como Alexa 594, en la yema de un ser organizado de células de tipo salvaje o el embrión transgénico GFP. Como ejemplo se inyectaron en embriones de Alexa 594 de tipo salvaje en el estadio de una célula. Nosotros les permitió desarrollar a gástrula escudo escenario y luego se llevó a cabo el trasplante de cerebro anterior objetivo, como se mencionó anteriormente, sino que trasplantadas a tg [GFAP: nuc-GFP] transgénicos anfitrión gástrula. Imagen del telencéfalo dorsal por microscopía confocal de barrido láser fluorescente reveló racimos rojos de las células del donante entre GFP + núcleos dentro del cerebro anterior (Fig. 2B). Asimismo, analizaron este host mediante la recopilación de Z-pilas cada tres minutos durante el transcurso de dos horas con el láser confocal de barrido. 4-dimensional prestación de este timelapse el uso de software Volocity (Improvisación) muestra dinámica de los movimientos celulares de las membranas celulares rodamina unº del GFP + núcleos (Movie 2). Haz click aquí para ver una versión ampliada de la figura 1. Figura 1: Aparato de Trasplantes y esquemática de los métodos experimentales. Un aparato) que se utiliza para llevar a cabo la etapa de gástrula trasplantes. El microscopio Zeiss Lumar estéreo fluorescente se utilizó para llevar a cabo estos trasplantes. Que tiene el foco y el zoom mando controlado (izquierda círculo rojo). El NK TransferMan se utilizan para manipular la posición de los capilares, que es también el joystick controlado (a la derecha del círculo rojo). Durante la instalación de 60 a 80 embriones se colocan en pocillos de agar individuales anteriores en una placa de Petri de 100 mm con un molde de plástico (cuadro morado se indica). El trasplante capilar (TransferTip) fabricados por Eppendorf tiene una abertura de 15μm de diámetro interior y una punta en ángulo de 20 grados (caja verde se indica). La aspiración de las células es controlado con Airtram Eppendorf (recuadro rojo indica). B) Ilustración del procedimiento de trasplante de gástrula etapa de donantes en los embriones de acogida. Las células se extraen de tg [GFA: GFP] embriones (en la foto) o Alexa 594 inyectado (como se describe en el protocolo) embriones de donantes. Las células se extraen de la línea media, a medio camino entre el escudo y el polo animal, y trasplantado en la misma región de los embriones de acogida. Los anfitriones son fijos y utilizando imágenes láser microscopía confocal de barrido. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura 2. Figura 2. Ejemplo de los trasplantes de fase de gástrula en el cerebro anterior pez cebra A) Una vista frontal de la salvaje embriones tipo de host con trasplantado tg [GFA: GFP]. Diencephalons las células en el telencéfalo y el cerebro anterior de pez cebra. Los axones están marcados en rojo (α-tubulina acetilada de anticuerpos) y las células trasplantadas se marcan en verde (GFP expresión endógena). Los embriones son 30 HPF. El recuadro muestra la morfología de las células gliales radiales + GFP. B) Vista dorsal del telencéfalo de vivir tg [GFAP: nuc-GFP] embrión de acogida con Rodamina fluorescente las células trasplantadas (rojo). Los núcleos de embriones de acogida están etiquetados en verde (GFP). La línea de puntos describe la superficie anterior del cerebro anterior. Línea continua indica la zona ventricular. Barra de escala es 10μm. Movie 1. . La relación de ectópica etiquetados células gliales radiales entre las comisuras del cerebro anterior células de una gástrula etapas tg [GFA: GFP] embriones fueron transplantados a una línea que no transgénico GFP de tipo salvaje. Un láser confocal de barrido Z-Stack se recogió y procesó a continuación para el 3-D de representación utilizando software Volocity. Inicialmente, la imagen es una vista frontal del cerebro anterior en el pez cebra 30hpf, y ha sido volteada horizontalmente, en comparación con la Figura 2B. Axones (a-tubulina acetilada, rojo) dentro de la comisura anterior (CA, arriba) y después de la comisura óptica (POC, abajo) se ven. Las células verdes son las buenas prácticas agrarias + células trasplantadas y sus raíces en el cerebro anterior y generó claras morfología glía radial. Como avanza la película se centra en dos de las células gliales radiales que poseen cuota final que en contacto con el POC. Haga clic aquí para descargar la película 1. Movie 2. Timelapse imágenes de trasplantados Alexa 594 células marcadas en el cerebro anterior células de una gástrula previamente inyectados con Alexa 594 fueron trasplantados en tg. [GFAP: nuc-GFP] embriones transgénicos. Esta película representa una proyección en 3-D de una series de tiempo 2 horas, en la que Z-pilas fueron tomadas cada 5 minutos. Z-pilas se recogieron en un microscopio confocal de barrido láser, y 4-D representaciones completado el uso de software Volocity. Las células trasplantadas se etiquetan con Alexa 594 (rojo), y las buenas prácticas agrarias + núcleos son de color verde. Como este timelapse corre, la imagen 4D comienza con una vista dorsal del cerebro anterior en 30hpf y girará sobre el eje X, como el movimiento de claro se detecta en las membranas celulares de las células trasplantadas y en las buenas prácticas agrarias + núcleos también. Haga clic aquí para descargar la película 2.
