Часть 1: Alexa 594 Маркированный Эмбрионы 1,1 пластины Микроинъекция и иглы подготовка Создание микроинъекции пластин Подготовка инъекций пластин состоит из трех-пяти 1-мм желоба в форме агарозы с помощью метода, по-Уэстерфилд, 2007 1. Эти желоба будут ожидающий провести эмбрионов в линию для эффективной и систематической микроинъекций. До принятия пластин, взять три 1-мм, 4-дюймовый долго без лампы накаливания капилляров и аккуратно разбить их на две части. Использование суперклей, клей два из этих 2-дюйма длиной капилляров бок о бок на ровную поверхность. Клей третьего капилляра на вершине этих двух, расположенный в роще, создавая форму пирамиды с тремя капиллярами. Дайте высохнуть и повторите, пока достаточно "корыта формы» построены. Залейте 20-25 мл (5 мм глубиной) расплавленного 1,5% агарозы в зачаточном состоянии среды (ЭМ) [5 мМ NaCl, 0.17mM KCl, CaCl 2 0,33 мм, 0,33 мм MgSO 4 и 0,00003% метиленового синего] в 100 мм чашке Петри. Сразу же месте 4:57 из ранее сделанных пирамидальной формы впадины до нижней пластины обеспечения плоской стороной формы соприкасается нижней части чашки Петри и полностью покрыт агарозы. Когда агарозном укрепил, стеклянный капилляр формы должны быть вывезены. Чтобы удалить, вырезать большой площади агарозном содержащих трех капиллярных пресс-форм. Осторожно выбить агар на периферии квадратных вырезать и выбросить. Флип квадратный кусок агар снова и, с использованием тонких щипцы, полностью удалить корыта пресс-форм. Залейте расплавленную агарозы в чашке Петри вокруг площади, чтобы провести новые формованные скважин на месте. Пусть множество. Плиты могут быть парафильмом опечатаны и храниться в течение недели при температуре 4 ° C. Отменить на признаки какого-либо роста в агар. Иглы для микроинъекций. Используйте микропипеткой капиллярной съемник сделать необходимые инъекции иглами из 1-мм, 4-дюймовый стеклянных капилляров с внутренним нити. Иглы потянулись использованием Flamming / коричневый микропипеткой Съемник с теплом 550, тяговое усилие 120, скорость 200, а времени / задержка 200. 1,2 эмбрионов и настройка аппарата Микроинъекция Оплодотворенные яйца сразу собранную после того как они заложили и поддерживается в чашке Петри заполнены EM. Введение флуоресцентных декстраны идеально подходит на один-клеточной стадии, и должна быть завершена к 16-клеточной стадии 2. Используя широкий пипетки стеклянным наконечником, изгнать эмбрионов в лунки инъекций комнатной температуре пластины заполнены EM. Аккуратно клин эмбрионов в нижней части желоба со сложенными тупой пинцет. Эмбрионы которого хориона или желток, были скомпрометированы должен быть уничтожен. Нагрузка инъекционной иглой с 1-2μl разреженного флуоресцентные Alexa 594 решения (5% по весу в 0,2 М KCl). Разрешить декстран для поездки в кончик инъекционной иглой под действием капиллярных сил из-за встроенных нитью по всей длине инъекционной иглой. Прикрепить инъекции иглу капиллярной обладатель стереотаксической микроманипулятора. Отрегулируйте давление на аппарат microinjector начать с 40-50 Psi и длительностью импульса 500msec. Аккуратно пасти кончик инъекционной иглой, чтобы сломать печать щипцами (идеальный диаметр 0,05 0,15 мм). Использование steromicroscope, изгнать декстрана на микрометр с минеральным маслом поверх него для калибровки иглы. Изменить размер болюса, регулируя давление воздуха, длительность импульса и размера иглы. Болюсного размер эквивалентно объемом 0,8-1nl следует поддерживать в течение 3 инъекции. Часто советы забиваются частицами желток; регулировка давления или разрыва кончике иглы может решить проблему, в противном случае новой иглой должен быть загружен. 1,3 Микроинъекции флуоресцентных Alexa 594 Под большим увеличением, начиная с одного конца корыта, плавно прокалывать хориона и клеточные мембраны эмбрионов войти в желтке. Inject решение декстран только под камеру. Убедитесь в том, чтобы удалить инъекционной иглой с тем же плавным движением используется для входа в эмбрион. Перемещение чашку Петри на позицию следующего встроенный эмбриона и продолжают инъекционных по всей длине желоба. Проверьте давление и болюсного размер периодически. Будьте осторожны, чтобы не перенести или согнуть инъекционной иглой, когда он находится в зародыше, поскольку это, скорее всего, смертельно повреждения эмбриона и / или разрыв инъекционной иглой. Аккуратно нажмите эмбрионов из желоба щипцами. Передача их в чашку Петри, заполненные антибиотиками Pen / Шаг EM, как описано в Nusslein-Фольхард и Дам (2002) (1 мл 6,5 млн. CaCl 2, 1 мл 3.5M NaHCO 3, 25 мл 20-кратным ЭМ и 10 мл 60mg/ml пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина йОк) при подготовке к трансплантации позже. Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° С и монитор для неоплодотворенные яйца или эмбриона смерти. Часть 2: Трансплантации гаструлы 2,1 Dechorionating и подготовка трансплантации пластины Dechorionating пластин. Dechorionated эмбрионы, которые еще не завершены epiboly требуют мягкой пластины дно, чтобы не иметь их желтком придерживаются и рвать на plastic.The день до пересадки, используя 1,5% агарозном решение описанных выше, сделать dechorionating пластин при заливке 5 -10 мл расплавленной агарозы в 100 мм чашке Петри. Только тонкий слой агарозы (2-3мм) необходимо, чтобы смягчить эмбрионов во время dechorination. Дайте остыть. Пересадка пластин. Специализированные пластин с разделенными скважины должны быть сделаны как описано в разделе 4. Налейте 30 мл 1,5% раствора агарозы в 100 мм чашках Петри и вставьте трансплантации также плесень. Форма должна содержать 104 треугольной дерн каждая состоит из трех сторон 90 градусов и один 45 градусов угловой стороной. Скважины предназначены для хранения двух эмбрионов бок о бок (рис. 1А, фиолетовый вставку). Будьте осторожны, не воздух, пузыри под плесени. Пусть агарозном затвердевать. Удаление плесень показывает, затонувшего область, содержащую квадратных скважин с наклонным краем. 2,2 эмбрионов и настройка трансплантации аппарата Позиционирование на донора и реципиента эмбрионов Развитие хостов и доноры должны быть проверены, чтобы поддерживать почти ровесников из пар. Чтобы сделать это, эмбрионы могут быть подняты при различных температурах (25-31 ° С), чтобы замедлить или ускорить развитие соответственно. Оба хозяина и доноров эмбрионов должна быть рука dechorionated на агар-покрытием dechorionating пластины за 1 час до желаемого возраста В случае гаструлы пересадки это должно быть завершено к 5hpf. До щит стадии, при 5.5hpf хост и донорских эмбрионов загружаются в пересадке пластины заполнены антибиотик EM. Эмбрионы будут загружены в отдельных 1-мм скважин с использованием стеклянной пипетки. Например выглядит следующим образом: первая строка заполняется доноров эмбрионов (18 Всего два эмбриона на лунку) и следующие две строки заполнены с принимающими эмбрионов (одного эмбриона на лунку, 9 эмбрионов на строку). Настройка аппарата пересадки Трансплантация проводится на Zeiss LUMAR флуоресцентный микроскоп стерео, которая полностью автоматизирована, джойстик контролируемой зум и фокус манипуляции. Хотя пересадка может быть сделано без этого автоматизации микроскопом она значительно повышают удобство и эффективность особенно когда большое количество операций по пересадке желательно. Установить Эппендорф AirTram к среднему месту нахождения его масштаба. Подключение до AirTram (рис. 1А, красная коробка) трубки в капилляр держателя, а также обеспечить владельцу микроманипулятора Эппендорф автоматизированные (рис. 1А). Это микроманипулятора полностью автоматизирован и джойстик под контролем. Опять же, это автоматизация полностью не необходимо, но значительно улучшает те, способность ориентироваться иглу вокруг и в зародыше. Кроме того, многие исследователи предпочитают OilTram, что, как говорят, предлагают гладкой контроль клеточного коллекции, однако у нас не было трудностей с AirTram. Капилляры были использованы стерильные Эппендорф TransferTips (ES), которые имеют 15 м скошенными открытие на кончике и 20 градусов согнуты угол 1 мм от кончика (рис. 1А зеленом поле). 2,3 Гаструла трансплантации клеточной стадии На 6hpf, используя микроманипулятора мягко пасутся эмбриона с кончика капилляра, чтобы повернуть в положение эмбриона для сотовых извлечения такой, что ее средняя линия и щит видны и противоположные кончика капилляра. Аспирируйте небольшое количество EM в капилляр, чтобы предотвратить любую возможность клетки, контактирующие воздух-вода, которая может привести к повреждению клеток. На основе карты судьбы данио, ориентации клетки переднего мозга требуется трансплантация клеток в средней линии точно между полюсом животных и щит 5. Аккуратно проткнуть эктодермы донорских эмбрионов (родамина вводят или GFP трансгенных эмбрионов) в этом месте. Толщина клеток между эктодермы и подстилающей желток в гаструлы тонкая, поэтому будьте осторожны, чтобы не проколоть желток, поскольку это часто приводит к смерти в течение часа. Использование клетки AirTram аспирации медленно в капилляр. Всегда сохранять видимость ватерлинии. Незначительные агитации наконечник в то время как в донорской поможет потерять межклеточных контактов. Примерно 10-50 клеток от доноров эмбрионов должны быть извлечены, прежде чем он удаляется из эмбриона. Удаление капиллярной от донора, так же ориентироваться хозяин, и проколет и изгнать клеток в точном самне расположение между полюсом животных и щит принимающих эмбрионов. После пересадки, доноров и принимающих эмбрионы удаляют из скважин, разделенных и аккуратно размещены на агар покрытием чашке Петри заполнены антибиотик EM. Оставив эмбрионов в пересадке скважин увеличивается смертность. Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° C. 2,4 Визуализация и обработка изображений эмбрионов Монтаж фиксированных и живых эмбрионов. Хост эмбрионов основе трансгенных GFP или родамина вводят эмбрионы могут быть визуализированы и отображаемого жив или как фиксированная эмбрионов. Здесь мы приведем примеры как фиксированная и жить вариантов визуализации. Fix эмбрионы были принесены в жертву на 30hpf используя 4% paraformadehyde в 0,1 М фосфатного буфера (РВ) в течение ночи при 4 C 1. Промыть эмбрионы 2x, а затем промыть 3 х 5 минут в 0,1 М PB. В примере, мы предоставляем, фиксированная хозяева immunolabeled для всех аксонов с антителами, направленными против ацетилированный тубулина (α-AT), как описано выше 6. Место эмбрионов в 75% глицерина, раковина при комнатной температуре, а затем хранить при 4 ° C. Подготовка слайдов для установки двух эмбрионов. Создайте два вазелин квадратных очертания на слайде, которые соответствуют внутри формы и диаметра квадратных покровное. Deyolk эмбриона и фронтальный вид переднего мозга, рассекают от переднего мозга за счет сокращения перпендикулярно мозга. Разместите эту ткань с минимальным количеством глицерина в нефтяной хорошо. Восток ткани в соответствующее положение и место покровное над образцом. Живая образца были установлены в размере 0,75% агарозном решение составляется в 4%-ный раствор Tricaine (в EM) на дно стеклянной посуды культуры. До затвердевания агарозы, эмбрион манипулировать с вольфрамовой иглой правильно ориентировать его для работы с изображениями. Для нашего анализа мы ориентированной переднего мозга непосредственно к покровным. Изображений Как фиксированные, так и живут хозяева отображаемого использованием Leica SP5 лазерного сканирования конфокальной микроскопии. Z-стеки были приобретены и 3 – или 4-мерной обработки изображений была завершена использованием Volocity программного обеспечения. Результаты: В целях рассмотрения вопроса о роли астроглиальных клеток переднего мозга необходимо как визуализировать эти клетки и ориентированы на различные генетические манипуляции на небольшие группы диэнцефальных и telencephalic клеток. Для создания этих видов химерных эмбрионов, в которых некоторые части астроглиального населения в эмбрион отличается ли от генотип или фенотип, мы использовали комплексный подход, сочетающий использование GFP трансгенные эмбрионы, которые астроглией этикетки, с использованием гаструлы -ступенчатую клеточной трансплантации. Чтобы конкретно нацелены наши клонов промежуточного мозга, мы использовали судьба данио гаструлы карте выборочно экстракт клеток в средней линии на равном расстоянии от полюсов животных и щит 5 (рис. 1В). Эти извлечения тг [GFAP: GFP] Затем клетки пересаживают в том же месте в дикого типа хост гаструлы, который затем был увеличен до 30hpf и immunolabeled для всех аксонов (α-тубулина ацетилированный) в качестве справочного ориентиры для анатомии мозга. В качестве примера здесь показано, конфокальной микроскопии одного хоста эмбрион показывает изолированных GFP + клеток по всему конечного мозга и промежуточного мозга (рис. 2). Полную морфологию этих GFP + клеток можно наблюдать в этом клонального анализа, показывая, что большинство из этих клеток приобретают характерный радиальной глии морфологии, где сомы находится рядом с желудочковой зоны и большую ногу конца завершает радиальных процесса на пиальных поверхности (рис. 2, вставка). Трехмерная оказание Z-стек из этих собранных оптических ломтиками ясно показали позицию этих клеток по отношению к меченых аксонов (фильм 1). Другой подход широко используется для визуализации пересаженных клеток первоначально microinject флуоресцентный краситель линии клеток, например, Alexa 594, в желтке одноклеточных постановке дикого типа или GFP трансгенных эмбрионов. В качестве примера мы вводили Alexa 594 в диких эмбрионов типа на один-клеточной стадии. Мы позволили им развиваться, чтобы оградить стадии гаструлы, а затем осуществляется переднего мозга целевых трансплантации как упоминалось выше, но вместо этого мы пересадить в тг [GFAP: пис-GFP] трансгенных хост гаструлы. Визуализация спинной конечного мозга путем лазерного сканирования конфокальной микроскопии показало, флуоресцентный красный кластеров донорских клеток среди GFP + ядер внутри переднего мозга (рис. 2В). Кроме того, мы проанализировали эту гостиницу, собирая Z-стеки каждые три минуты в течение двух часов с лазерной сканирующей конфокальной. 4-мерном оказание этой timelapse использованием Volocity программное обеспечение (импровизация) показывает динамические сотовой движения родамина клеточных мембраной GFP + ядер (фильм 2). Нажмите здесь, чтобы видеть большую версию рисунке 1. Рисунок 1: аппарат трансплантации и схема экспериментальных методов. А) Аппарат используется для проведения стадии гаструлы трансплантации. Zeiss LUMAR флуоресцентный микроскоп стерео был использован для проведения таких трансплантаций. Он имеет джойстика контролируемой фокусировки и зума (левый красный круг). Transferman НК была использована для манипулирования положением капиллярных который также джойстик управления (правый круг красного цвета). Во время установки 60-80 эмбрионы помещаются в отдельных скважинах агар ранее сделанные в 100 мм чашки Петри с пластиковых форм (фиолетовый прямоугольник). Пересадка капилляра (TransferTip) производства Эппендорф имеет 15мкм внутренний диаметр отверстия и 20 градусов угловой наконечник (зеленый прямоугольник). Стремление клеток контролируется с AirTram Эппендорф (красный прямоугольник). Б) Иллюстрация гаструлы трансплантации процедуры от донора в принимающих эмбрионов. Клетки извлекаются из тг [GFAP: GFP] эмбрионы (как показано здесь) или Alexa 594 вводят (как описано в протоколе) доноров эмбрионов. Клетки будут удалены от средней линии на полпути между щитом и животных полюса, и пересадить в том же регионе принимающих эмбрионов. Хосты являются фиксированными и отображаемого использованием лазерного сканирования конфокальной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке 2. Рисунок 2. Пример гаструлы пересадки в переднем мозге данио) фронтальный вид дикого типа хост эмбрионов с пересаженной тг [GFAP: GFP]. Клеток в diencephalons и конечного мозга переднего мозга рыбок данио. Аксоны помечены красным цветом (α-тубулина ацетилированный антитела) и пересаженные клетки помечены зеленым цветом (эндогенной экспрессии GFP). Эмбрионы 30 HPF. На врезке показано радиальной глии морфологии клеток GFP +. Б) Спинной зрения конечного мозга живого тг [GFAP: пис-GFP] хост эмбриона с родамина флуоресцирующих трансплантированных клеток (красный). Ядра хост эмбрионов помечены зеленым цветом (GFP). Пунктирная линия очертания передней поверхности переднего мозга. Сплошная линия указывает желудочковой зоны. Шкала бар 10 мкм. Фильм 1. . Отношения эктопически помечены радиальных глиальных клеток переднего мозга у спайки Клетки из гаструлы поставил тг [GFAP: GFP] эмбриона были пересажены в не-трансгенных GFP дикого типа линии. Лазерный сканирующий конфокальный Z-Stack была собрана, а затем обрабатывается в течение 3-D рендеринге с использованием Volocity программного обеспечения. Первоначально изображение фронтального зрения данио переднего мозга на 30hpf, и это было перевернуть горизонтально, по сравнению с рис 2B. Аксоны (ацетилированный-тубулина, красный) в передней спайки (AC, вверху) и после-оптических спайки (СПЭ, внизу) не видно. Зеленые клетки GFP + пересаженных клеток, которые укоренились в переднем мозге и порожденных ясно радиальной глии морфологии. Как фильм прогрессирует она фокусируется на двух радиальных глиальных клеток, обладающих конце плату, что контакт ВОУ. Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 1. Фильм 2. Timelapse изображений пересаженных Alexa 594 меченых клеток в переднем мозге клетки из гаструлы ранее вводили Alexa 594 были пересажены в тг. [GFAP: пис-GFP] трансгенных эмбрионов. Этот фильм представляет собой 3-D проекции таймсерии 2h, в котором Z-стеки были взяты каждые 5 минут. Z-стеки были собраны на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, а также 4-D визуализации закончить через Volocity программного обеспечения. Пересаженные клетки помечены Alexa 594 (красный), и GFP + ядер зеленые. Поскольку это timelapse работает, изображение 4D начинается с спинной стороны переднего мозга на 30hpf и будет вращаться вокруг оси Х, как ясно обнаружении движения в клеточных мембранах всех пересаженных клеток и в GFP + ядрах. Нажмите здесь чтобы скачать фильм 2.
