Partie 1: Alexa 594 embryons marqués 1.1 Plate microinjection et préparation d'aiguille Faire plaques microinjection Préparer les plaques d'injection composé de trois à cinq creux de 1 mm dans un moule d'agarose en utilisant une technique par Westerfield, 2007 1. Ces bacs seront snuggly détiennent les embryons dans une ligne pour microinjections efficace et systématique. Avant de faire les plaques, prendre trois de 1 mm, 4-pouce de long non filaments capillaires et soigneusement les casser en deux. En utilisant la superglue, colle à deux de ces 2 pouces capillaires longues côte à côte sur une surface plane. Collez le troisième capillaire sur le dessus de ces deux, niché dans la palmeraie, créant une forme de pyramide avec les capillaires trois. Laisser sécher et répéter jusqu'à ce que suffisamment de «moules creux» sont construits. Verser 20-25mL (profondeur 5mm) de fusion de 1,5% d'agarose en milieu d'embryon (EM) [5 mM de NaCl, KCl 0.17mm, 0.33mm CaCl 2, MgSO 4 et 0.33mm 0,00003% de méthylène bleu] dans un plat de Pétri de 100 mm. Immédiatement lieu trois à cinq des moules préalablement fait cuvette en forme de pyramide au fond de la plaque assurer le côté plat du moule est de toucher le fond de la boîte de Pétri et complètement recouverte par l'agarose. Lorsque la gélose s'est solidifiée, les moules capillaire en verre doivent être pris. Pour l'enlever, couper un grand carré d'agarose contenant les trois moules capillaire. Doucement déloger la gélose à la périphérie de la place couper et jeter. Retournez le morceau de gélose carré sur, et en utilisant une pince fine, supprimer complètement les moules creux. Verser agarose fondu dans la boîte de Pétri autour de la place pour maintenir le puits nouvellement moulés en place. Laisser reposer. Les plaques peuvent être parafilm scellées et stockées pendant des semaines à 4 ° C. Jeter moins de signes de croissance dans la gélose. Aiguilles pour microinjections. Utilisez un extracteur micropipette capillaire font les aiguilles d'injection nécessaire de 1 mm, les capillaires de 4 pouces en verre avec filament interne. Aiguilles ont été tirés à l'aide de la Flamming / Extracteur micropipette Brown avec une chaleur de 550, force de traction de 120, la vitesse de 200, et un temps / délai de 200. 1.2 collecte d'embryons et Appareillage microinjection Les oeufs fécondés sont immédiatement recueillis après avoir été posées et maintenues dans une boîte de Pétri remplie d'EM. L'injection de dextranes fluorescents est idéal, au stade d'une cellule et doit être rempli par le stade de 16 cellules 2. En utilisant une pipette en verre pointe large, d'expulser les embryons dans le puits d'une plaque d'injection à température ambiante remplis avec EM. Doucement coin des embryons dans le fond des creux avec une pince émoussée jointes. Embryons dont chorion ou le jaune ont été compromis doit être jeté. Chargez l'aiguille d'injection de 1-2μl des diluée fluorescents Alexa 594 solution (5% en poids de 0,2 M de KCl). Laisser le dextrane de se rendre à la pointe de l'aiguille d'injection par capillarité due au filament intégrées sur toute la longueur de l'aiguille d'injection. Fixez l'aiguille d'injection pour le titulaire capillaires d'un micromanipulateur stéréotaxique. Régler la pression sur l'appareil microinjecteur pour commencer avec 40-50 Psi et durée d'impulsion de 500 ms. Doucement broutent la pointe de l'aiguille d'injection de briser le sceau avec une pince (diamètre idéal est de 0,05 à 0,15 mm). L'utilisation d'un steromicroscope, expulser le dextrane sur un micromètre avec de l'huile minérale au sommet de celui-ci pour calibrer l'aiguille. Modifier la taille du bolus en ajustant la pression de l'air, la durée de l'impulsion et la taille de la pointe de l'aiguille. Une taille de bolus équivalent à un volume de 0,8-1NL devrait être maintenue tout au long des injections 3. Souvent conseils deviendra bouché par des particules jaunes; ajustant la pression ou la rupture de la pointe de l'aiguille peut atténuer le problème, sinon une aiguille d'injection de nouvelles doivent être chargées. 1,3 microinjections d'fluorescent Alexa 594 Sous un fort grossissement, à partir d'une extrémité de l'auge, en douceur percer le chorion et la membrane cellulaire des embryons d'entrer dans le jaune. Injecter la solution de dextrane juste sous la cellule. Assurez-vous de retirer l'aiguille d'injection avec le même mouvement en douceur permet d'entrer l'embryon. Déplacer la boîte de Pétri pour positionner la ligne suivante et embryons continuent de s'injecter la longueur de l'auge. Vérifiez la pression et la taille de bolus périodiquement. Soyez prudent de ne pas déplacer ou plier l'aiguille d'injection quand il est dans l'embryon comme cela est susceptible d'endommager les fatalement embryon et / ou casser l'aiguille d'injection. Poussez doucement les embryons hors du creux avec une pince. Les transférer à une boîte de Pétri remplie de Pen antibiotique / Etape EM tel que décrit dans Nüsslein-Volhard et Dahm (2002) (1ml 6,5 M CaCl 2, 1ml 3.5M NaHCO 3, 25ml et 10ml 20x EM de 60mg/ml pénicilline, 100 mg / St ml de streptomycineOCK) en préparation pour les transplantations plus tard. Incuber les embryons à 28,5 ° C et surveiller les œufs non fécondés ou la mort des embryons. Partie 2: Les transplantations stade gastrula 2,1 Dechorionating et la préparation des plaques Transplant Dechorionating plaques. Dechorionated embryons qui n'ont pas terminé épibolie nécessitent une plaque de fond douce afin de ne pas avoir leur jaune d'adhérer et de larme sur la journée plastic.The avant transplantation, en utilisant la solution d'agarose 1,5% précédemment décrits, faire des plaques en versant 5 dechorionating -10 ml d'agarose fondu dans un plat de Pétri de 100 mm. Seule une mince couche d'agarose (2-3mm) est nécessaire pour amortir les embryons pendant dechorination. Laissez refroidir. Plaques de greffe. Plaques spécialisée avec des puits séparés doivent être réalisés comme décrit en 4. Verser 30 ml de la solution de 1,5% d'agarose dans un plat de Pétri de 100 mm et d'insérer une greffe ainsi moule. Le moule doit contenir 104 divots triangulaires composées chacune de trois côtés 90 degrés et 45 degrés d'un côté incliné. Les puits sont conçus pour tenir deux embryons côte-à-côté (Fig. 1A, boîte violette). Prenez soin de ne pas emprisonner des bulles d'air sous le moule. Laissez durcir la agarose. Élimination de la moisissure révèle une zone contenant les puits creuses carrées avec un bord en pente. 2,2 embryon et Appareillage Transplant Positionnement des embryons donateurs et d'accueil Développement d'hôtes et les donateurs doivent être surveillés afin de maintenir à proximité de couples appariés selon l'âge. Pour ce faire, les embryons peuvent être soulevées à des températures variant (25-31 ° C) pour ralentir ou accélérer le développement, respectivement. Les deux hôtes et les embryons des donateurs devrait être la main sur une gélose dechorionated enduit la plaque dechorionating 1 heure avant l'âge désiré Dans le cas des greffes de stade gastrula cela besoin d'être complété par 5hpf. Avant de bouclier de l'étape, à l'hôte et les embryons 5.5hpf donateurs sont chargés dans une assiette remplie de greffe EM antibiotique. Les embryons sont chargés dans l'individu de 1 mm de puits à l'aide d'une pipette en verre. Un exemple est la suivante: la première rangée est remplie avec des embryons donateurs (18 au total, deux embryons par puits) et les deux lignes suivantes sont remplies avec des embryons d'accueil (un seul embryon par puits, 9 embryons par rangée). Mise en place du dispositif de la transplantation Les transplantations sont réalisées sur le microscope Zeiss Lumar stéréo fluorescents qui a entièrement automatisé, de zoom et de manipulation contrôlée manette de discussion. Alors que les greffes peut être fait sans cette automatisation du microscope qu'il ferait considérablement augmenter la facilité et efficacité, en particulier quand un nombre élevé de greffes est souhaitée. Réglez le Airtram Eppendorf à l'emplacement milieu de son échelle. Connectez jusqu'à l'Airtram (Fig. 1A, boîte rouge) au titulaire du tube capillaire, et fixer le support à l'micromanipulateur Eppendorf automatisés (figure 1A). Cette micromanipulateur est entièrement automatisée et contrôlée joystick. Encore une fois, cette automatisation n'est pas absolument nécessaire, mais améliore significativement la capacité de celles de naviguer l'aiguille autour et dans l'embryon. Sinon, de nombreux chercheurs préfèrent l'OilTram ce qui est dit pour offrir un meilleur contrôle de la collecte de cellules, mais nous n'avons pas eu des difficultés avec le Airtram. Les capillaires utilisés sont stériles Eppendorf TransferTips (ES) qui ont un 15 m biseautés ouverture au bout et un angle de 20 degrés plié 1mm de la pointe (Fig. 1A boîte verte). 2.3 Les transplantations de cellules Gastrula scène Au 6hpf, en utilisant le micromanipulateur délicatement broutent l'embryon avec la pointe du capillaire pour faire pivoter l'embryon dans la position pour les extractions de cellule de telle sorte que sa ligne médiane et le bouclier sont visibles et s'opposer à la pointe de la capillarité. Aspirer une petite quantité de EM dans le capillaire pour éviter tout risque de contact des cellules à l'interface air-eau, ce qui endommagerait les cellules. Basé sur la carte sort le poisson-zèbre, ciblant les cellules à l'prosencéphale nécessite la transplantation de cellules sur la ligne médiane exactement entre le pôle animal et le bouclier 5. Doucement percer l'ectoderme de l'embryon donneur (rhodamine injectée ou GFP embryons transgéniques) à cet endroit. L'épaisseur des cellules entre l'ectoderme et le jaune sous-jacente dans la gastrula est mince et, par conséquent, faire preuve de prudence pour ne pas empaler le jaune car cela conduit souvent à la mort en quelques heures. En utilisant les cellules aspirer Airtram lentement dans le capillaire. Toujours maintenir la visibilité de la ligne d'eau. Une légère agitation de la pointe alors que dans le donateur aidera à perdre les contacts cellule-cellule. Environ 10-50 cellules de l'embryon donneur doit être extrait avant qu'il ne soit retiré de l'embryon. Retirez le capillaire du donneur, à l'instar d'orienter l'hôte, et percer et d'expulser les cellules dans le exacte SAme trouve entre le pôle animal et le bouclier d'embryons hôte. Après la transplantation, les embryons donateurs et d'accueil sont retirés des puits, séparés et délicatement placée sur une boîte de Petri de gélose revêtement remplis avec EM antibiotique. Laissant embryons dans les puits de greffe augmente la mortalité. Embryons Incuber à 28,5 ° C. 2.4 Visualisation et imagerie embryons Montage embryons fixes et vivre. Hôte embryons issus de transgéniques GFP ou la rhodamine embryons injectés peuvent être visualisées et imagé embryons vivants ou fixés. Nous présentons ici des exemples des deux options d'imagerie fixe et direct. Fixer les embryons ont été sacrifiés à l'aide 30hpf paraformadehyde 4% en tampon phosphate 0,1 M (PB) nuit à 4 C 1. Rincez embryons 2x, puis laver 3 x 5 minutes dans 0,1 M PB. Dans l'exemple que nous offrons, les hôtes ont été fixés pour tous les axones immunomarquées avec des anticorps dirigés contre la tubuline acétylée (α-AT) comme décrit précédemment 6. Placer les embryons dans le glycérol 75%, d'un évier à température ambiante puis conserver à 4 ° C. Préparer une diapositive de monter deux embryons. Créer deux contours carrés de gelée de pétrole sur une lame qui correspondent à la forme à l'intérieur et le diamètre d'une lamelle carré. Deyolk un embryon et pour une vue frontale du cerveau antérieur, disséquer hors du prosencéphale en coupant perpendiculairement sur le mésencéphale. Placez ce tissu avec une quantité minimale de glycérol dans le puits de pétrole. Orienter le tissu dans la position appropriée et placer une lamelle sur le spécimen. Spécimen vivant ont été montées dans une solution de 0,75% d'agarose composé dans une solution de 4% de tricaïne (en ME) sur des boîtes à fond de verre de la culture. Avant la solidification d'agarose, l'embryon est manipulé avec une aiguille de tungstène pour orienter correctement l'd'imagerie. Pour notre analyse, nous avons orienté le prosencéphale directement contre la lamelle. Imagerie Les deux machines fixes et de vivre ont été imagées en utilisant le Leica SP5 microscope confocal à balayage laser. Z-Piles ont été acquises et 3 – ou de traitement d'image en 4 dimensions a été réalisée en utilisant le logiciel Volocity. Résultats: Dans un effort pour aborder le rôle des cellules dans le cerveau antérieur astrogliales il est nécessaire de visualiser à la fois à ces cellules et de cibler les différentes manipulations génétiques pour des petits groupes de cellules diencéphaliques et télencéphalique. Pour générer ces types d'embryons chimériques, dans laquelle une certaine partie de la population astrogliales dans l'embryon est différent que ce soit par le génotype ou le phénotype, nous avons utilisé une approche multidimensionnelle qui combine l'utilisation d'embryons transgéniques GFP, dont les étiquettes astroglie, avec l'utilisation de la gastrula -mise en scène de transplantation cellulaire. Pour cibler spécifiquement les clones pour le diencéphale, nous avons utilisé la carte zebrafish sort gastrula d'extraire sélectivement des cellules sur la ligne médiane à égale distance du pôle animal et le bouclier 5 (Fig. 1B). Ces extraits tg [GFAP: gfp] cellules ont ensuite été transplantées dans le même endroit dans un hôte de type sauvage gastrula, qui a ensuite été porté à 30hpf, et pour tous les axones immunomarquées (α-tubuline acétylée) comme points de repère pour l'anatomie du cerveau antérieur. À titre d'exemple montré ici, l'imagerie confocale d'un embryon hôte révèle isolés cellules GFP + dans le télencéphale et diencéphale (figure 2A). La morphologie complète de ces cellules GFP + peut être observée dans cet essai clonal, révélant que la plupart de ces cellules prennent la morphologie caractéristique gliales radiales, où le soma est adjacent à la zone ventriculaire et un pied grande extrémité se termine un processus radiale à la de surface pial (figure 2A, en médaillon). Rendu en trois dimensions de la Z-stack de ces tranches optiques recueillies montrent clairement la position de ces cellules à l'égard des axones marqués (film 1). Une autre approche couramment utilisée pour visualiser les cellules transplantées est d'abord un colorant microinject cellules fluorescentes lignée, comme Alexa 594, dans le jaune d'une cellule mise en scène de type sauvage ou transgénique GFP embryon. Comme exemple nous avons injecté dans des embryons Alexa 594 de type sauvage au stade d'une cellule. Nous leur avons permis de se développer au bouclier stade gastrula puis effectué la transplantation du cerveau antérieur ciblées comme mentionné ci-dessus, mais nous avons transplanté dans tg [GFAP: nuc-gfp] hôte transgénique gastrula. L'imagerie du télencéphale dorsal par microscopie confocale à balayage laser a révélé grappes rouges fluorescentes des cellules du donneur chez les GFP + noyaux dans le cerveau antérieur (figure 2B). Nous avons également analysé cet hôte par la collecte des piles Z toutes les trois minutes au cours de deux heures avec le confocale à balayage laser. 4-dimensionnel rendu de cette timelapse en utilisant le logiciel Volocity (Improvisation) montre dynamique des mouvements cellulaires des membranes cellulaires rhodamine uneND de la GFP + noyaux (Film 2). ? Cliquez ici pour voir une plus grande version de la figure 1. Figure 1: un appareil de transplantation et schématique des méthodes expérimentales. Un appareil) utilisée pour mener gastrula au stade des greffes. Le microscope Zeiss Lumar stéréo fluorescent a été utilisé pour effectuer ces greffes. Il a joystick attention contrôlée et un zoom (à gauche cercle rouge). Le NK TransferMan a été utilisée pour manipuler la position du capillaire qui est aussi contrôlée joystick (cercle rouge de droite). Lors de l'installation de 60 à 80 embryons sont placés dans des puits individuels agar préalablement faite dans un plat à 100mm de Pétri avec un moule en plastique (violet boîte décrites). La greffe capillaire (TransferTip) fabriqué par Eppendorf a un diamètre d'ouverture 15μm intérieure et un pourboire de 20 degrés angulaires (boîte verte décrites). L'aspiration des cellules est contrôlée avec Airtram Eppendorf (rouge encadré décrit). B) Illustration de la procédure de transplantation gastrula étape du donneur dans des embryons hôtes. Les cellules sont extraites de tg [GFAP: GFP] embryons (illustré ici) ou Alexa 594 injectés (comme décrit dans le protocole) des embryons donateurs. Les cellules sont retirés de la ligne médiane à mi-chemin entre le blindage et pôle animal, et transplanté dans la même région d'embryons hôte. Les hôtes sont fixes et imagées par microscopie confocale à balayage laser. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 2. Figure 2. Exemple de greffes stade gastrula dans le prosencéphale zebrafish a) une vue frontale d'embryons hôtes sauvages type avec transplanté tg [GFAP: gfp]. Cellules dans le diencéphale et le télencéphale du cerveau antérieur poisson zèbre. Les axones sont étiquetés en rouge (anticorps tubuline α-acétylé) et les cellules transplantées sont étiquetés en vert (expression de la GFP endogène). Les embryons sont 30 HPF. En médaillon montre la morphologie radiale gliales de cellules GFP +. B) Vue dorsale du télencéphale d'un live tg [GFAP: nuc-GFP] embryon hôte avec la rhodamine fluorescente cellules transplantées (rouge). Les noyaux des embryons hôtes sont étiquetés verte (GFP). La ligne pointillée indique la face antérieure du cerveau antérieur. Trait plein indique la zone ventriculaire. La barre d'échelle est 10 microns. Film 1. . La relation de façon ectopique étiquetés cellules gliales radiales entre les commissures prosencéphale cellules d'une gastrula scène tg [GFAP: GFP] embryons ont été transplantés dans une ligne non-GFP transgénique de type sauvage. Un confocale à balayage laser Z-Stack ont été recueillies puis traitées pour la 3-D en utilisant un logiciel de rendu Volocity. Initialement, l'image est une vue frontale du cerveau antérieur poisson zèbre au 30hpf, et il a été retourné horizontalement par rapport à la figure 2B. Les axones (a-tubuline acétylée, rouge) dans la commissure antérieure (CA, en haut) et post-optique commissure (POC, en bas) sont visibles. Les cellules vertes sont les cellules GFP + transplantés qui a pris racine dans le prosencéphale et généré claires morphologie radiale gliales. Comme le film progresse, il se concentre sur deux dans les cellules gliales radiales possédant frais de la fin que le contact de la CEP. Cliquez ici pour télécharger la vidéo 1. Movie 2. Timelapse imagerie des transplantés Alexa 594 cellules marquées dans le prosencéphale cellules d'une gastrula préalablement injecté avec Alexa 594 ont été transplantées dans tg. [GFAP: nuc-gfp] embryons transgéniques. Ce film représente une projection en 3-D d'une série chronologique 2h, dans lequel Z-piles ont été prises toutes les 5 minutes. Z-Piles ont été recueillies sur un microscope confocal à balayage laser, et 4-D rendus complété en utilisant le logiciel Volocity. Cellules transplantées sont étiquetés avec Alexa 594 (rouge), et GFP + noyaux sont verts. Comme cette timelapse fonctionne, l'image 4D commence par une vue dorsale du cerveau antérieur au 30hpf et tourner autour de l'axe X, comme un mouvement clair est détecté dans les membranes cellulaires de toutes les cellules transplantées et de la GFP + noyaux ainsi. Cliquez ici pour télécharger la vidéo 2.
