الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

الجزء 1 : 594 الأجنة إعتبر اليكسا 1.1 بلايت Microinjection وإعداد الإبرة صنع لوحات microinjection إعداد لوحات الحقن يتكون من ثلاثة أحواض لل1 ملم five ضمن قالب agarose باستخدام تقنية بواسطة Westerfield ، 2007 1. وسوف تعقد هذه الأحواض سنججلي الأجنة في خط لmicroinjections فعالة ومنهجية. قبل اتخاذ لوحات ، واتخاذ ثلاثة 1 ملم ، 4 بوصة طويلة الشعيرات الدموية غير خيوط وكسر بعناية إلى النصف. superglue به ، الغراء اثنين من هذه الشعيرات الدموية 2 بوصة طويلة جنبا إلى جنب على سطح مستو. الغراء الشعرية الثالثة على رأس هذين ، والتي تقع في البستان ، وخلق شكل الهرم مع الشعيرات الدموية الثلاثة. السماح ليجف ثم كرر حتى يتم بناؤها بما فيه الكفاية "قوالب الحضيض". صب 20 25mL (عمق 5mm) من المنصهر agarose 1.5 ٪ في المتوسط ​​الجنين (EM) [كلوريد الصوديوم 5mm ، و بوكل 0.17mM ، 0.33mM CaCl 2 ، 0.33mM MgSO 4 و 0.00003 ٪ الميثيلين الأزرق] في طبق بتري 100mm. المكان فورا 3-5 من القوالب التي سبق حوض على شكل الهرم إلى أسفل لوحة ضمان الجانب المسطح من العفن لمس الجزء السفلي من طبق بتري ومغطاة بالكامل من قبل agarose. عندما agarose وطدت ، يجب أن تؤخذ في قوالب الزجاج الشعرية خارج. لإزالة ، وقطع مربعة agarose الكبيرة التي تحتوي على القوالب الشعرية three. طرد بلطف أغار على محيط ساحة قص وتجاهل. الوجه قطعة مربعة فوق وآغار ، وذلك باستخدام ملقط غرامة ، وإزالة القوالب الحضيض. صب المنصهر agarose في صحن بتري حول الساحة لعقد الآبار مصبوب حديثا في مكانها. ترك مجموعة. يمكن أن تكون لوحات parafilm مختومة وتخزينها لعدة أسابيع في 4 درجات مئوية. تجاهل أي علامات على النمو في أجار. إبر للmicroinjections. استخدام مجتذب Micropipet الشعرية جعل إبر الحقن اللازمة للخروج من 1 ملم والشعيرات الدموية الزجاج 4 بوصة مع خيوط داخلية. وتم سحب الإبر باستخدام Flamming / براون بولير Micropipet مع الحرارة من 550 ، وسحب القوة من 120 ، سرعة 200 ، ومرة ​​/ تأخير 200. 1.2 جمع الأجنة والإعداد جهاز Microinjection يتم جمع البويضات المخصبة على الفور بعد أن يتم زرعها وصيانتها في طبق بتري مليئة EM. حقن dextrans الفلورسنت مثالية في مرحلة واحدة الخلية ، وينبغي أن يتم الانتهاء من المرحلة 16 خلية 2. باستخدام ماصة طرف زجاج واسعة ، وطرد الأجنة في آبار الحقن لوحة درجة حرارة الغرفة مليئة EM. إسفين بلطف الأجنة في الجزء السفلي من أحواض مع ملقط شبك كليلة. يجب التخلص من الأجنة التي المشيماء أو صفار اختراقهما. تحميل إبر الحقن مع 2μl – 1 من 594 المخفف الفلورسنت حل اليكسا (5 ٪ من وزنها في بوكل M 0.2). السماح للسفر إلى ديكستران غيض من إبرة حقن من خلال العمل الشعري بسبب خيوط تشغيل مضمن طول إبرة الحقن. إرفاق الإبرة الحقن لصاحب الشعرية من micromanipulator المجسم. ضبط الضغط على جهاز microinjector أن تبدأ مع هذه المبادرة ومدتها 40-50 نبض 500msec. رعي بلطف غيض من إبرة حقن لكسر الختم مع ملقط (قطر المثالي هو 0.05 – 0.15mm). باستخدام steromicroscope ، وطرد ديكستران على ميكرومتر مع الزيوت المعدنية فوق منه لمعايرة الإبرة. تعديل حجم بلعة عن طريق ضبط ضغط الهواء ، ومدة النبضة وحجم رأس الإبرة. ينبغي الحفاظ على حجم بلعة يعادل حجم 1nl – 0.8 الحقن طوال 3. غالبا ما تصبح انسداد نصائح مع جزيئات صفار ، وتعديل ضغط أو كسر رأس الإبرة قد تخفف من المشكلة ، وإلا يجب أن يتم تحميل إبرة حقن جديدة. 1.3 من 594 Microinjections اليكسا نيون تحت التكبير العالية ، بدءا من واحدة من نهاية الحوض الصغير ، وعلى نحو سلس يخترق غشاء الخلية المشيماء والأجنة للدخول في صفار البيض. حقن محلول ديكستران مباشرة تحت الخلية. تأكد من إزالة إبرة الحقن مع الحركة السلسة نفسها المستخدمة للدخول إلى الجنين. نقل طبق بتري لوضع الجنين مضمنة المقبل وتستمر باستمرار ضخ على طول الحوض. تحقق من ضغط وحجم بلعة دوريا. يجب الحرص على عدم نقل أو ينحني إبرة الحقن عندما يكون في الجنين وهذا هو عرضة للتلف قاتلة الجنين و / أو كسر إبرة الحقن. دفع برفق أجنة من أحواض بالملقط. نقلها إلى طبق بتري مليئة القلم المضادات الحيوية / EM الخطوة كما هو موضح في Nusslein – فولهارد وDahm (2002) (1ml 6.5M CaCl 2 ، 1ml 3.5M NaHCO 3 ، 25ml 20X EM 10ML من البنسلين و60mg/ml ، 100mg / ش مل الستربتوميسيناوك) في التحضير لعملية زرع في وقت لاحق. احتضان الأجنة في 28.5 درجة مئوية ، ورصد للبويضة غير مخصبة أو موت الجنين. الجزء 2 : مرحلة الزرع المعيدة 2.1 Dechorionating وزرع إعداد اللوحة Dechorionating لوحات. Dechorionated الأجنة التي لم تكتمل تتطلب اكتفار لوحة أسفل الناعمة حتى لا يكون صفار على التمسك بها والمسيل للدموع في اليوم plastic.The قبل الزرع ، وذلك باستخدام حل agarose 1.5 ٪ التي سبق وصفها ، وجعل لوحات dechorionating بصب 5 -10 مل من agarose المنصهر في طبق بتري 100mm. وهناك حاجة سوى طبقة رقيقة من agarose (2 – 3mm) للتخفيف من الأجنة أثناء dechorination. السماح لتبرد. لوحات الزرع. وحات المتخصصة مع الآبار فصل الحاجة إلى بذل كما هو موضح في 4. صب 30ml من الحل agarose 1.5 ٪ في طبق بتري 100mm وإدراج عملية زرع العفن جيدا. يجب أن تحتوي على 104 قالب divots الثلاثي يتألف كل من الجانبين three درجة 90 وجهة الزاوية 45 درجة. وقد صممت هذه الآبار لعقد اجتماعين الأجنة جنبا إلى جنب (الشكل 1A ، مربع اللون الأرجواني). الحرص على عدم اعتراض فقاعات الهواء تحت العفن. السماح لتتصلب agarose. إزالة العفن يكشف عن المنطقة المنكوبة التي تحتوي على بئر مربعة مع حافة منحدر. وزرع الأجنة 2.2 إعداد جهاز المواقع الأجنة المانحة والمضيفة تطوير المضيفين والمانحين بحاجة الى مراقبة للحفاظ على قرب الأزواج في سن المتطابقة. للقيام بذلك ، يمكن أن تثار أجنة في درجات حرارة متفاوتة (25-31 درجة مئوية) لإبطاء أو تسريع التنمية على التوالي. يجب على المضيفة والمانحة تكون الأجنة على يد dechorionated ساعة dechorionating آغار المغلفة 1 صفيحة قبل سن المطلوب في حالة زرع مرحلة المعيدة هذا سيكون من الضروري الانتهاء من 5hpf. يتم تحميلها قبل الدرع المرحلة ، في استضافة 5.5hpf المانحة والأجنة في زرع صفيحة مليئة EM المضادات الحيوية. يتم تحميل الأجنة في آبار 1 ملم الفردية باستخدام ماصة الزجاج. على سبيل المثال كما يلي : يتم تعبئة الصف الأول مع أجنة المانحة (18 مجموع ، واثنين من الأجنة لكل بئر) وتمتلئ التالية صفين مع أجنة المضيف (جنين واحد لكل بئر ، 9 الأجنة لكل صف). إعداد جهاز زرع وتجرى عمليات زرع على المجهر Lumar زايس ستيريو الفلورسنت التي ، عصا التحكم الآلي بالكامل التكبير للرقابة والتلاعب التركيز. في حين يمكن أن يتم من دون زرع هذا أتمتة المجهر فإنه لا زيادة كبيرة في سهولة وكفاءة وخصوصا عندما هو المطلوب عدد كبير من عمليات الزرع. تعيين AirTram إيبندورف إلى الموقع وسط نطاقه. توصيل ما يصل إلى (الشكل 1A ، مربع أحمر) AirTram أنابيب لصاحب الشعرية ، وتأمين لحامل micromanipulator إيبندورف الآلي (الشكل 1A). هذا هو micromanipulator مؤتمتة بالكامل والتي تسيطر عصا التحكم. مرة أخرى ، هذا ليس من الضروري أتمتة تماما ولكن يحسن بشكل ملحوظ منها القدرة على التنقل في جميع أنحاء الإبرة والى الجنين. بدلا من ذلك ، العديد من الباحثين يفضلون OilTram أن يقال لتقديم سلاسة السيطرة على جمع الخلية ، ولكن لم نجد أي صعوبة مع AirTram. كانت تستخدم الشعيرات العقيمة إيبندورف TransferTips (ES) التي تحتوي على 15 مترا مشطوف فتح على الحافة وتميل بزاوية 20 درجة 1MM من طرف (الشكل المربع الأخضر 1A). 2،3 زرع خلية المرحلة المعيدة في 6hpf ، وذلك باستخدام micromanipulator رعي بلطف الجنين مع غيض من الشعرية لتدوير الجنين في موقف لإخراج مثل هذه الخلية أن خط الوسط ، ودرع مرئية ومعارضة غيض من الشعيرات الدموية. نضح على كمية صغيرة من EM في الشعيرات الدموية لمنع أي فرصة للخلايا واجهة الاتصال بين الهواء والماء ، التي من شأنها أن تدمر خلايا. استنادا إلى خريطة مصير الزرد ، واستهداف الخلايا إلى الدماغ المقدم يتطلب زرع الخلايا في المنتصف تماما بين القطب الحيواني والدرع 5. بيرس بلطف الأديم الظاهر للأجنة المانحة (رودامين حقن أو الأجنة GFP المعدلة وراثيا) في هذا الموقع. سمك الخلايا بين الأديم الظاهر وصفار الكامنة في المعيدة رقيقة ، وبالتالي ، عدم توخي الحذر أسعد صفار حيث سيؤدي ذلك غالبا ما تؤدي إلى الوفاة في غضون ساعات. باستخدام الخلايا نضح AirTram ببطء في الشعيرات الدموية. دائما الحفاظ على وضوح من خط المياه. والتحريض طفيف للطرف بينما في الجهة المانحة لمساعدة فضفاضة خلية خلية الاتصالات. وينبغي استخراج ما يقرب من 10-50 خلايا من الجنين قبل الجهات المانحة يتم إزالته من الجنين. إزالة الشعيرات من الجهة المانحة ، وبالمثل توجيه المضيف ، وبيرس ، وطرد الخلايا في الدقيقة سالي مكان بين القطب الحيواني ودرع من الأجنة المضيفة. بعد الزرع ، ويتم إزالة الأجنة المانحة والمضيفة من الآبار ، وفصلها ووضعها برفق على طبق بتري آجار مغلفة مليئة EM المضادات الحيوية. ترك الأجنة في زرع الآبار يزيد معدل الوفيات. الأجنة في احتضان 28.5 درجة مئوية. 2.4 تصور وتصوير الجنين تصاعد الأجنة ثابتة وحية. يمكن المضيف المستمدة من الأجنة وراثيا أو الأجنة GFP رودامين حقن يمكن تصور وتصوير أجنة حية أو الثابتة. نقدم هنا أمثلة لكلا الخيارين التصوير ثابتة وحية. تمت التضحية أجنة الإصلاح في 30hpf باستخدام paraformadehyde 4 ٪ في 0.1M الفوسفات العازلة (PB) بين عشية وضحاها في 4 ج 1. شطف 2X الأجنة ثم يغسل 3 × 5 دقائق في PB 0.1M. في المثال التي نقدمها ، ويستضيف immunolabeled الثابتة لجميع المحاور مع الأجسام المضادة الموجهة ضد تويولين الأسيتيل (α – AT) كما هو موضح سابقا 6. الأجنة في مكان الجلسرين 75 ٪ ، وتغرق في درجة حرارة الغرفة ثم تخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد شريحة لجبل اثنين من الأجنة. إنشاء اثنين من الفازلين على مربع يحدد الشريحة التي تطابق الشكل وداخل القطر من ساترة مربع. Deyolk الجنين للحصول على عرض والأمامية من الدماغ الأمامي ، تشريح الدماغ المقدم قبالة عن طريق خفض عموديا عبر الدماغ المتوسط. مكان هذا النسيج مع كمية صغيرة من الجلسرين داخل البترول أيضا. توجيه الأنسجة في المكان المناسب ووضع ساترة فوق العينة. وقد شنت العينة يعيشون في حل agarose 0.75 ٪ تتكون في محلول 4 ٪ من Tricaine (في EM) على الأطباق الزجاجية الثقافة القاع. قبل ترسيخ agarose ، يتم التلاعب بها الجنين بإبرة التنغستن لتوجيه بشكل صحيح للتصوير. نحن لدينا لتحليل المنحى في الدماغ المقدم مباشرة ضد ساترة. التصوير وتستضيف كل من تصوير ثابتة وحية باستخدام مجهر المسح الضوئي لايكا SP5 ليزر متحد البؤر. وقد اكتسبت Z – الأكوام و 3 — 4 أو اكتمل الأبعاد معالجة الصور باستخدام برنامج Volocity. النتائج : في محاولة للتصدي للدور الخلايا في الدماغ الأمامي astroglial فمن الضروري على كل من تصور هذه الخلايا المستهدفة والتلاعب الجيني مختلفة لمجموعات صغيرة من خلايا الدماغ البيني والدماغ الانتهائي. لتوليد هذه الأنواع من أجنة خيالية ، والذي جزء من السكان astroglial داخل الجنين مختلفة سواء عن طريق التركيب الوراثي أو النمط الظاهري ، كنا مقاربة متعددة الأوجه التي تجمع بين استخدام الأجنة وراثيا GFP ، التي تصف دبق نجمي الخلايا ، مع استخدام المعيدة نظمت – زرع الخلايا. خصيصا لاستهداف استنساخ لدينا في الدماغ البيني ، استخدمت نحن مصير المعيدة الزرد خريطة لاستخراج الخلايا بشكل انتقائي في خط الوسط على مسافة واحدة من القطب الحيواني والدرع 5 (الشكل 1B). هذه المستخرج TG [gfap : GFP] ثم تم زرع الخلايا في نفس الموقع في المعيدة نوع المضيف البرية ، والتي أثيرت ثم 30hpf وimmunolabeled لكافة المحاور (α – الأسيتيل تويولين) ومعالم مرجعية لتشريح الدماغ المقدم. كمثال على ذلك هو موضح هنا ، والتصوير مبائر الجنين يكشف عن استضافة أحد معزولة GFP + الخلايا في جميع أنحاء telencephalon والدماغ البيني (الشكل 2A). ويمكن ملاحظة أن التشكل الكامل لهذه الخلايا + GFP في هذا الاختبار نسيلي ، وكشف عن أن معظم هذه الخلايا تأخذ على التشكل سمة الدبقية شعاعي ، حيث يقع سوما المتاخمة للمنطقة البطين وقدم نهاية كبيرة إنهاء عملية شعاعي في حنوني السطح (الشكل 2A ، أقحم). تقديم ثلاثي الأبعاد للZ – كومة من هذه الشرائح الضوئية التي جمعت وأظهرت بوضوح موقف من هذه الخلايا فيما يتعلق المحاوير المسمى (فيلم 1). مقاربة أخرى تستخدم عادة لتصور الخلايا التي تم زرعها في البداية microinject النسب صبغة الفلورسنت الخلية ، مثل اليكسا 594 ، في صفار من خلية واحدة شنت نوع الجنين GFP البرية أو المعدلة وراثيا. كمثال على ذلك فإننا اليكسا حقن 594 نوع الأجنة في البرية في مرحلة واحدة الخلية. سمحنا لهم لتطوير درع للمرحلة المعيدة ثم نفذت استهدفت زرع الدماغ المقدم على النحو المذكور أعلاه ، ولكن بدلا من ذلك نحن في زرع TG [gfap : مجلس التوحيد الوطنى ، GFP] المضيف المعيدة المعدلة وراثيا. وكشف التصوير من telencephalon الظهرية بواسطة الفحص المجهري ليزر متحد البؤر المسح مجموعات من الخلايا الحمراء الفلورسنت بين المانحين GFP + النوى داخل الدماغ الأمامي (الشكل 2B). نحن لمزيد من التحليل من خلال جمع هذا المضيف Z – مكدسات كل ثلاث دقائق على مدى ساعتين مع ليزر متحد البؤر المسح الضوئي. 4 الأبعاد مما يجعل من هذا timelapse باستخدام البرمجيات Volocity (الارتجال) يبين الحركات الخلوية الحيوية للأغشية الخلية رودامين aالثانية في GFP + النوى (الفيلم 2). فوق لها أن ترى نسخة أكبر من الرقم 1. الشكل 1 : زرع جهاز التخطيطي والأساليب التجريبية. جهاز) المستخدمة لإجراء عمليات زرع في مرحلة المعيدة. تم استخدام المجهر Lumar زايس ستيريو الفلورسنت لإجراء عمليات زرع هذه. انها تركز عصا التحكم والتكبير (يسار الدائرة الحمراء). تم استخدام NK Transferman لمعالجة الموقف من الشعرية التي هي أيضا عصا التحكم (دائرة حمراء على اليمين). أثناء الإعداد توضع الأجنة في آبار 60-80 آغار الفردية المقدمة سابقا في طبق بتري 100mm مع قالب من البلاستيك (اللون الأرجواني مربع المبين). زرع الشعرية (TransferTip) المصنعة من قبل إيبندورف ديه 15μm فتح القطر الداخلي وتلميح الزاوية 20 درجة (الصندوق الأخضر المذكورة). يتم التحكم في الخلايا مع تطلعات AirTram إيبندورف في (مربع أحمر المبين). ب) رسم توضيحي لمرحلة المعيدة من إجراء عمليات زرع أجنة في المانحة المضيف. يتم استخراج خلايا من TG [gfap : GFP] أجنة (كما هو موضح هنا) أو اليكسا حقن 594 (كما هو موضح في بروتوكول) الأجنة المانحة. تتم إزالة الخلايا من خط الوسط في منتصف الطريق بين الدرع والقطب الحيواني ، وزرعها في نفس المنطقة من الأجنة المضيفة. يتم إصلاح المضيفين وتصويرها باستخدام ليزر متحد البؤر المجهر. الرجاء النقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2. الشكل 2. مثال على زرع مرحلة المعيدة داخل الدماغ المقدم الزرد أ) عرض أمامية من نوع البرية الأجنة المضيفة مع زرع [gfap : GFP] TG. الخلايا في diencephalons وtelencephalon الدماغ المقدم من الزرد. وصفت المحاوير في الحمراء (α – الأسيتيل تويولين الضد) ويطلق عليها الخلايا التي تم زرعها في الأخضر (تعبير GFP الذاتية). الأجنة هي 30 HPF. أقحم يظهر الدبقية مورفولوجيا شعاعي من الخلايا + GFP. ب) عرض الظهرية للtelencephalon من TG الحية [gfap : مجلس التوحيد الوطنى ، GFP] الجنين المضيف مع رودامين الاستشعاع الخلايا المزروعة (الحمراء). وصفت نوى الأجنة المضيفة في الأخضر (GFP). يحدد خط متقطع السطح الأمامي من الدماغ الأمامي. خط الصلبة يشير إلى منطقة البطين. شريط المقياس 10μm. الفيلم 1. نظمت العلاقة بين الخلايا الدبقية المسمى ectopically شعاعي بين خلايا الدماغ المقدم commissures من المعيدة TG [gfap : GFP]. تم زرع الجنين في خط المعدلة وراثيا غير GFP اكتب البرية. وكان مسح ليزر متحد البؤر Z – المكدس ثم جمعها ومعالجتها لمدة 3 – D جعل استخدام البرمجيات Volocity. في البداية ، كانت الصورة وجهة نظر الأمامي من الدماغ المقدم في 30hpf الزرد ، ولقد كان انقلبت أفقيا مقارنة الشكل 2B. وتعتبر المحاور (A – الأسيتيل تويولين ، أحمر) ضمن الصوار الأمامي (AC ، أعلى) وآخر البصرية صوار (POC ، القاع). الخلايا الخضراء هي GFP + الخلايا المزروعة التي تجذرت في الدماغ الأمامي واضحة الشعاعية الناتجة الدبقية التشكل. كما تقدم الفيلم أنه يركز على الخلايا اثنين في الدبقية الشعاعية التي تمتلك رسوم نهاية الاتصال POC. انقر هنا لتحميل الفيلم 1. الفيلم 2. Timelapse التصوير من زرع خلايا اليكسا 594 إعتبر في الدماغ الأمامي تم زرع خلايا من المعيدة حقن سابقا مع اليكسا 594 إلى TG [gfap : مجلس التوحيد الوطنى ، GFP] الأجنة وراثيا. هذا الفيلم يمثل الإسقاط 3 – D لtimeseries 2H ، التي اتخذت Z – مكدسات كل 5 دقائق. جمعت Z – الأكوام على مسح بالليزر مبائر المجهر ، و 4 – D الاداءات الانتهاء باستخدام البرمجيات Volocity. وصفت الخلايا التي تم زرعها مع اليكسا 594 (الحمراء) ، ونوى GFP + خضراء. لأن هذا timelapse تشغيل صورة 4D يبدأ عرض الظهرية من الدماغ المقدم في 30hpf وستدور حول محور X ، كما تم الكشف عن حركة واضحة في أغشية الخلايا من جميع الخلايا التي تم زرعها وفي GFP + نوى كذلك. اضغط هنا لتحميل الفيلم 2.