Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme
Summary
Biz bir tarif<em> In vivo</em> Floresan görüntüleme protokolü, hem sağlıklı ve distrofik farelerin iskelet kas içine transplantasyonu sonrası GFP-etiketli matür kas yenilenme izlemek. Bu protokol, diğer tip hücre nakli ve diğer kaslı koşulların yanı sıra kas yenilenme çalışma adapte edilebilir.
Abstract
Musküler distrofiler kontraktil kas hücrelerinin progresif kaybı ile karakterize dejeneratif kas hastalıklarının bir grup. Şu anda herhangi bir iyileştirici bir tedavi yoktur. Kök hücre biyolojisi son gelişmeler bu hastalıkları tedavi etmek için etkili bir hücre bazlı tedavilerin geliştirilmesi için yeni umutlar yarattı. Distrofik hayvan modelleri kas içine floresan proteinleri ile etiketlenmiş kök hücrelerin çeşitli türleri Nakli alanında geniş anlamda kullanılmıştır. Nakledilen hücre kaderi takip etmek yeteneğine sahip bir non-invaziv bir tekniktir boyuna, daha doğru ve verimli bir şekilde nakledilen hücrelerin kas engraftman değerlendirmek için yetenek daha.
Bu çalışmada, in vivo floresan görüntüleme nakledilen GFP (Yeşil Floresan Protein) etiketli fare iskelet kaslarında hücre izlemek için duyarlı ve güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir. Floresan protein uyarma için gerekli harici bir ışık kullanımı nedeniyle geçmişi hakkında endişe rağmen, çıplak ya da fareyi kullanarak ya da epilasyon reaktifler saç ortadan kaldırarak çok bu sorunun ortadan olduğu bulundu. CCD kamera kullanarak, floresan sinyal GFP transgenik fareler veya eGFP transduced myoblast kültür ya da 5 x 10 5 hücre enjeksiyonu sonra tibialis anterior kas (TA) tespit edilebilir. Ekstansör digitorum longus (EDL), daha az hücre enjeksiyonu gibi daha yüzeysel kasları için saptanabilir bir sinyal üretir. Sinyal yoğunluğu ölçülür ve ilgi (ROI) bir bölgede saniyede fotonların sayısı olarak sayılabilir olabilir. Edinilen görüntüleri engrafted alan net sınırlarının çizilmesi, ROI boyutu olarak ölçülebilir. Bacaklarda sürekli her zaman konumda iseniz, kas ve ROI boyutu başına saniyede fotonların toplam sayısı değişiklikler engrafted hücrelerinin sayısında değişiklikler ve engrafted alanının boyutunu yansıtmaktadır. Bu nedenle zaman içinde aynı kas değişiklikleri ölçülebilir. In vivo floresan görüntüleme tekniği tumorogenic hücrelerinin büyümesini izlemek için öncelikle kullanılan olmuştur, bizim çalışmamızda, nakledilen kök hücrelerin kaderi takip etmek için bize sağlayan güçlü bir araç olduğunu göstermektedir.
Protocol
Discussion
Biz bu çalışmada ana iskelet kası floresan etiketli nakledilen hücrelerin izlemek için güvenilir ve istikrarlı bir görüntüleme platformu kurdu. GFP transgenik fare GFP etiketli matür yetişkin kök hücreler gelecekte hücre tedavisi için aday olacak bir tür için duruyor. Hücre sayısı, hücre enjeksiyonu, açık arka plan, görüntüleme konumunu ve makine parametresi de dahil olmak üzere sürekli bir manipülasyon, yüksek kalitede görüntü elde ve özellikle kantitatif analiz için önemlidir.
Floresans görüntüleme non-invaziv, kolay olduğu gibi biyomedikal araştırmalarda birçok uygulamalar vardır ve yüksek kapasiteli. Buna ek olarak floresan görüntüleme, saçılma, zayıflama ve emilimi sayesinde de olsa, foton sayımı, dayanan kantitatif bir ölçüm sağlayabilir, ışık, doku büyük bir mesafe, bir teknik eksiklik nüfuz edemez. Kırmızı ya da yakın-kızılötesi ışık penetrasyon derinliğini artırmak için muhabir kullanmak için çalışmalar devam etmekte.
Floresan görüntüleme diğer bir avantajı, insan kullanımı için özel floresan muhabiri onaylanmıştır eğer klinikler çevrilebilir. Pahalı donanım ve görüntüleme ajanları gerektirmez, MR, CT, ve PET ile karşılaştırıldığında, floresan görüntüleme yüksek esnekliğe sahiptir. Bir örnek kliniklerde kullanılan floresan tabanlı endoskop ve mikro-endoskop. Floresan görüntüleme yöntemleri ile birleştirerek, biz altta yatan biyolojik süreçler ile ilgili anatomik ve fonksiyonel bilgi elde etme yeteneği elde etmek için bekliyoruz.
Acknowledgements
Z Y Yang ve Wang çalışmaları NIAMS / NIH hibe K02 AR051181 Müsküler Distrofi Derneği ve Harvard Kök Hücre Enstitüsü Y Wang için hibe ile mümkün olmuştur. , Q Zeng ve X Xu iş Brigham ve Kadın Hastanesi Optik Görüntüleme Laboratuvarı verilen bir program hibe ile desteklenmektedir. Yazarlar hücre çalışmalarına teknik yardım için Anestezi Anabilim Dalı, BWH Wen Liu teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
References
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, . fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 .
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. , (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
