で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

細胞の準備衛星細胞の単離麻酔下で、GFPトランスジェニックマウス（C57BL / KA -βactin- EGFP）の四肢筋が削除​​されます。小片に切断した後、衛星細胞は37℃で1時間2％ディスパーゼのコラゲナーゼ溶液とみじん切りの組織を培養することにより酵素的に解離して℃であるハムのF – 10および20％FBSを含む増殖培地で酵素消化を中和する、パスツールピペットで繰り返し摩砕によって筋肉を解離する。細胞は、細胞ストレーナー（Ø70 -100μmの）を通して濾過し、次いで37℃で1時間、ノンコーティングディッシュ℃の上にメッキされています静かにコラーゲンコートしたディッシュ上清とプレートそれらを削除します。筋芽細胞を浄化するために、このステップ1時間後に繰り返します。 （プレプレート） 時間内にメディアとプレートのセルを変更する。最終精製筋芽細胞は、37を含有する培地ハムF – 10、20％FBS、100 U / mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン（増殖培地）で培養されている℃、5％CO2、95％空気とC。 文化とは10 ng / mlの塩基性FGFの添加によって増殖培地中で一次筋芽細胞を展開します。 in vivo実験すべてでは、TAの筋あたり5 × 10 5細胞を注入する。 筋芽細胞を収穫するとき、我々は、0.25％トリプシン/ EDTAを用いて細胞を剥離し、PBSで2回それらを洗う。細胞数を、血球計でカウントされ、細胞を5 × 10 4細胞/μlの濃度でHBSSに再懸濁する。 HBSSで集中細胞を氷の上に置き、収集後1時間以内に注入される。 生体内撮像 4-6週間の年齢で雄のmdxマウスは、ジャクソン研究所から購入し、動物飼育設備で維持されています。 環境への宿泊施設の約一週間後、マウスは、培養細胞を移植する準備が整いました。 細胞移植の前に、マウスは、ケタミン（100 mg / kg体重）及びキシラジン（10 mg / kg）の混合物の腹腔内（ip）注射による麻酔です。その後、TAの筋面積約毛が足にNairさんを適用し、それを蒸留水できれいに拭くために30秒待つことによって削除されます。 マウスは、麻酔下に入れたまま、10μlのHBSSで5 × 10 5細胞は徐々に30ゲージの針を使用して3点でそれぞれのTAの筋肉に注入されています。 ステップ4の後、マウスは、定期的に生体内蛍光イメージングで撮像することができます。高感度電荷結合カメラを装備した蛍光イメージング駅NightOwl LB981（Berthold社Technologies社）は、マウスの妨げに足から画像を取得するために使用されます。 in vivoイメージングの日には、まずTAの筋で発毛を確認してください。必要に応じて、我々は、ケタミンとキシラジンの混合物で、マウスを麻酔した後、上記のような毛を削除するNairさんを再適用します。 マウスは麻酔がかかっているとき、我々は、黒以外の蛍光紙（ストラスモアから黒Artagain紙）上に腹臥位にマウスを置きます。完全に良くイメージングのためのTA筋肉を公開するには、我々は紙に後肢をテープ。 我々は、イメージングチャンバーと位置、カメラの視野の中心に撮像される後肢にマウスを置きます。我々は最初の5秒間の露光時間で足の伝統的なグレースケールの写真撮影をするために発光フィルターを切り替える。マウスの位置を再調整し、必要に応じてカメラの焦点。露光時間（1,250ミリ）、試料の高さ（0.9センチ）などを含む撮像パラメータは、実験過程で一定に保たれる。 私たちは、その後、緑色蛍光タンパク質の波長のために適切な排出のフィルタに切り替える。我々は1,250ミリ秒と1のビニング数の露光時間で蛍光画像を取る。イメージング後、マウスは回復を待つためにケージにイメージングチャンバーから除去される。 分析のために、我々は、毎秒の光子の面で彼らの強度を測定する蛍光シグナルを介して関心領域（ROI）を描く。我々はまた別の定量値として画素数の点ではROIの大きさを測定する。縦断的データを取得するために、必要に応じてイメージング実験は、数か月にわたって、より頻繁に毎週繰り返すか、することができます。 実験の終了時に、マウスを安楽死されており、TAの筋は組織学の分析のために収穫される。