Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging
Summary
Ci descrivono un<em> In vivo</em> Protocollo di imaging di fluorescenza di monitorare la rigenerazione muscolare GFP-etichettata dopo trapianto di mioblasti scheletrici nei muscoli di topi sani e distrofici. Questo protocollo può essere adattato a studio rigenerazione muscolare da trapianto di altri tipi di cellule e in altre condizioni muscolari così.
Abstract
Distrofie muscolari sono un gruppo di malattie muscolari degenerative caratterizzata dalla progressiva perdita di cellule muscolari contrattili. Attualmente, non esiste alcuna cura disponibile. I recenti progressi nella biologia delle cellule staminali hanno generato nuove speranze per lo sviluppo di terapie cellulari basate efficace per il trattamento di queste malattie. Trapianto di vari tipi di cellule staminali etichettati con proteine fluorescenti nei muscoli di modelli animali distrofici è stato utilizzato ampiamente nel settore. Una tecnica non invasiva con la capacità di seguire il destino delle cellule trapiantate longitudinalmente può ulteriormente la nostra capacità di valutare l'attecchimento del trapianto da cellule muscolari trapiantate più accurato ed efficiente.
Nel presente studio, abbiamo dimostrato che in vivo l'imaging di fluorescenza è un metodo sensibile e affidabile per il monitoraggio GFP trapiantati (proteina fluorescente verde)-etichettati cellule nei muscoli scheletrici del mouse. Nonostante la preoccupazione di fondo per l'utilizzo di una luce esterna necessaria per l'eccitazione di proteine fluorescenti, abbiamo scoperto che utilizzando il mouse nude o eliminando i capelli con reagenti depilazione molto di questo problema è eliminato. Utilizzando una fotocamera CCD, il segnale fluorescente può essere rilevato nel tibiale anteriore (TA) muscolare dopo l'iniezione di 5 x 10 5 cellule sia da topi transgenici GFP o eGFP trasdotte cultura mioblasti. Per i muscoli più superficiali come l'estensore lungo delle dita (EDL), l'iniezione di un minor numero di cellule produce un segnale rilevabile. Intensità del segnale possono essere misurate e quantificate come il numero di fotoni emessi al secondo in una regione di interesse (ROI). Dal momento che le immagini acquisite mostrano chiari confini che delimitano la zona innestata, la dimensione del ROI può essere misurata come bene. Se le gambe sono posizionate in modo coerente ogni volta, i cambiamenti nel numero totale di fotoni al secondo per muscolare e la dimensione del ROI riflettere le variazioni del numero di cellule trapiantate e le dimensioni della zona innestata. Pertanto, il cambiamento nel muscolo stesso nel corso del tempo sono quantificabili. In vivo tecnica di imaging a fluorescenza è stata utilizzata principalmente per rintracciare la crescita delle cellule tumorogenic, il nostro studio dimostra che è un potente strumento che ci consente di tenere traccia il destino delle cellule staminali trapiantate.
Protocol
Discussion
Abbiamo creato una piattaforma di imaging affidabile e stabile per il monitoraggio delle cellule trapiantate fluorescenza etichettati nel muscolo scheletrico ospitare in questo studio. GFP-etichettata da GFP mioblasti di topo transgenico cavalletti di un tipo di cellule staminali adulte che saranno candidati per la terapia cellulare per il futuro. Una manipolazione costante tra cui il numero delle cellule, l'iniezione di cellule, sfondo chiaro, la posizione delle immagini e dei parametri della macchina è importante per ottenere immagini di alta qualità e soprattutto per l'analisi quantitativa.
Fluorescenza imaging ha numerose applicazioni nel campo della ricerca biomedica in quanto non è invasiva, facile da usare, ed ha un throughput elevato. Inoltre l'imaging di fluorescenza in grado di fornire una misura quantitativa basata sulla conta fotone, anche se a causa della attenuazione dispersione e l'assorbimento, la luce non può penetrare una grande distanza nel tessuto, che è una lacuna della tecnica. Gli sforzi sono in corso per usare giornalista rosso o vicino infrarosso per aumentare la profondità di penetrazione della luce.
Un altro vantaggio di imaging di fluorescenza è che è traducibile alle cliniche se il giornalista specifico fluorescente è omologato per uso umano. Rispetto al MRI, CT, PET e, fluorescenza imaging ha un'elevata flessibilità in quanto non richiedono hardware costosi e gli agenti di imaging. Un esempio è fluorescenza a base di endoscopio e micro-endoscopio che sono stati utilizzati nelle cliniche. Grazie alla combinazione di imaging di fluorescenza con altre modalità, ci aspettiamo di raggiungere la capacità di acquisire informazioni sia anatomiche e funzionali sui processi biologici sottostanti.
Acknowledgements
Il lavoro di Z e Y Wang Yang è stato reso possibile da concedere K02 AR051181 da NIAMS / NIH, borse di studio da Distrofia muscolare e della Harvard Stem Cell Institute per Y Wang. Il lavoro di Zeng Q e X Xu sono supportati da una sovvenzione del programma assegnato al Laboratorio di Imaging Ottico dal Brigham e l'ospedale delle donne. Gli autori desiderano ringraziare Liu Wen dal Dipartimento di Anestesia, BWH, per un aiuto tecnico al lavoro delle cellule.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
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