מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה
Summary
אנו מתארים<em> In vivo</em> פלואורסצנציה הדמיה פרוטוקול לפקח התחדשות שריר על ידי ה-GFP שכותרתו myoblasts לאחר ההשתלה לתוך שרירי השלד של עכברים בריאים הן dystrophic. פרוטוקול זה ניתן להתאים ללמוד התחדשות שריר על ידי השתלה של סוגים אחרים של תאים בתנאים שרירים אחרים גם כן.
Abstract
Dystrophies שרירים הן קבוצה של מחלות שרירים ניוונית המאופיינת אובדן הדרגתי של בתאי שריר התכווצות. נכון לעכשיו, אין טיפול מרפא זמין. התפתחויות אחרונות ביולוגיה של התא גזע יצרו תקוות חדשות לפיתוח טיפולים יעילים תא מבוסס לטיפול במחלות אלה. השתלה של סוגים שונים של בתאי גזע שכותרתו עם חלבוני ניאון לתוך שרירי במודלים של בעלי חיים dystrophic נעשה שימוש רחב בתחום. טכניקה לא פולשנית עם יכולת לעקוב אחר גורל התא המושתל longitudinally יכולים להמשיך ביכולת שלנו להעריך engraftment שריר על ידי התאים המושתלים באופן מדויק יותר וביעילות.
במחקר הנוכחי, אנו מדגימים כי in vivo פלואורסצנציה הדמיה היא שיטה רגישה ואמינה למעקב אחר המושתלים GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) שכותרתו תאים עכבר שרירי השלד. למרות החשש על רקע עקב השימוש של אור חיצוני הכרחי עירור של חלבון פלואורסצנטי, מצאנו כי באמצעות העכבר או עירום או ביטול השיער עם חומרים כימיים להסרת שיער רב של בעיה זו מתבטלת. שימוש במצלמת CCD, האות ניאון ניתן לאתר את השריר הקדמי (ת"א) tibialis לאחר הזרקה של 5 x 10 5 תאים משני העכברים הטרנסגניים GFP או eGFP transduced תרבות myoblast. עבור השרירים השטחיים יותר כגון extensor digitorum longus (אדי), הזרקה של תאים פחות מייצר אות לזיהוי. עוצמת האות ניתן למדוד לכמת כמו מספר של פוטונים הנפלטים בשנייה באזור של עניין (ROI). מאז רכשה את התמונות להראות גבולות ברורים התוחם את האזור engrafted, בגודל של ההחזר על ההשקעה ניתן למדוד גם. אם הרגליים ממוקמות באופן עקבי כל הזמן, השינויים המספר הכולל של פוטונים לשנייה לכל שרירים בגודל של ההחזר על ההשקעה משקפים את השינויים במספר התאים engrafted ואת גודל השטח engrafted. לכן השינויים בשריר אותו לאורך זמן הם לכימות. In vivo טכניקת דימות פלואורסצנטי שימש בעיקר כדי לעקוב אחר הצמיחה של תאים tumorogenic, המחקר שלנו מראה כי זהו כלי רב עוצמה המאפשר לנו לעקוב אחר גורלם של בתאי גזע המושתלים.
Protocol
Discussion
אנו מקימים פלטפורמה אמינה ויציבה הדמיה למעקב אחר הקרינה על התאים המושתלים שכותרתו בשריר השלד מארח במחקר זה. GFP-שכותרתו myoblasts מ-GFP עכבר מהונדס מייצג סוג של בתאי גזע בוגרים שיהיו מועמדים טיפול בתא בעתיד. מניפולציה קבוע כולל מספר התאים, הזרקת תאים, רקע ברור, עמדה הדמיה פרמטר מכונת חשוב להשגת תמונה באיכות גבוהה במיוחד עבור ניתוח כמותי.
פלואורסצנטי הדמיה יש יישומים רבים במחקר ביו כפי שהוא אינו פולשני, קל לשימוש, ויש לו קצב העברת נתונים גבוה. בנוסף דימות פלואורסצנטי יכול לספק מדידה כמותית המבוססת על ספירת פוטון, אם כי בשל הנחתה פיזור, קליטה, האור לא יכול לחדור מרחק גדול רקמות, המהווה חיסרון של השיטה. מאמצים כבר בעיצומן להשתמש כתב אדום או קרוב אינפרא אדום כדי להגדיל את עומק החדירה של האור.
יתרון נוסף של דימות פלואורסצנטי היא שזה לתרגום למרפאות אם הכתב ניאון ספציפיים מאושר לשימוש האדם. לעומת MRI, CT, ו PET, פלואורסצנציה הדמיה יש גמישות גבוהה כפי שהוא אינו דורש חומרה יקרה וסוכני הדמיה. דוגמה אחת היא הקרינה מבוססי אנדוסקופ מיקרו אנדוסקופ שנוצלו במרפאות. על ידי שילוב של דימות פלואורסצנטי עם שיטות אחרות, אנו מצפים להשיג את היכולת לרכוש גם מידע אנטומי ותפקודי על התהליכים הביולוגיים הבסיסיים.
Acknowledgements
העבודה של Z ו-Y וואנג יאנג התאפשרה על ידי מענק K02 AR051181 מ NIAMS / NIH, מענקי ניוון שרירים האגודה הארוורד לתאי גזע המכון Y וואנג. העבודה של Q ו-X זנג שו נתמכים על ידי מענק תוכנית הוענק מעבדת דימות אופטי מן בריגהאם ובית החולים לנשים. המחברים מבקשים להודות ליו וון מהמחלקה של הרדמה, BWH, עזרה טכנית בעבודה התא.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
References
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, . fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 .
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. , (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
