Seguimiento de Dinámica de injerto muscular en pequeños animales por En Vivo Fluorescente de imágenes

Preparación de células Aislamiento de células satélite Bajo anestesia, los músculos de los miembros de la GFP ratones transgénicos (C57BL / Ka-βactin-EGFP) se retiran. Después de cortar en trozos pequeños, las células satélite están disociadas enzimáticamente por incubación del tejido picado con una solución de colagenasa dispasa 2% durante 1 hora a 37 ° C. Neutralizar la digestión enzimática con medios de cultivo que contienen Ham F-10 y el 20% de SFB, se disocian del músculo por trituración repetida con una pipeta Pasteur. Las células se filtran a través de un colador de células (Ø70-100μm) y luego colocan en un plato sin revestimiento durante 1 hora a 37 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante y la placa en un plato recubierto de colágeno. Repita este paso una hora más tarde para purificar los mioblastos. (Pre-placa) Cambiar el soporte y la placa de las células en el tiempo. Los mioblastos final purificado se cultivan en un medio que contiene Ham F-10, el 20% de SFB, 100 U de penicilina / ml, y 100 ug / ml de estreptomicina (medio de crecimiento) a 37 º C con CO2 al 5%, 95% de aire. La cultura y ampliar los mioblastos primarios en medio de cultivo con adición de FGF básico de 10 ng / ml. Para todos los experimentos in vivo, se inyecta 5×10 5 células por músculo TA. En la cosecha de los mioblastos, que separar las células mediante el uso de 0,25% de tripsina / EDTA y lavar con PBS dos veces. El número de células se contó con un hemocitómetro y las células se resuspendieron en HBSS a una concentración de 5×10 4 células / microlitro. Las células concentradas en HBSS se colocan sobre hielo y se inyecta dentro de una hora después de la recolección. Imágenes in vivo Mujer ratones mdx a la edad de 4-6 semanas se compran a Jackson de laboratorio y mantenidos en un centro de alojamiento de los animales. Después de una semana de alojamiento en el medio ambiente, los ratones están listos para ser implantados con las células cultivadas. Antes del trasplante de células, el ratón está anestesiado por un intraperitoneal (ip) de la mezcla de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). A continuación, el pelo alrededor de la zona del músculo TA se elimina mediante la aplicación de Nair en la pierna y esperar 30 segundos para limpiarla con agua destilada. Mientras que el ratón está todavía bajo la anestesia, 5×10 5 células en HBSS 10μl se inyecta lentamente en cada músculo TA a los 3 puntos con una aguja de calibre 30. Después del paso 4, el ratón se puede regular mediante imágenes en vivo de imágenes de fluorescencia. La imagen de fluorescencia estación Nightowl LB981 (Tecnologías de Berthold, Inc.), equipado con una alta sensibilidad de acoplamiento de carga de la cámara, se utiliza para obtener imágenes de las piernas obstaculizar de los ratones. En el día de imágenes in vivo, en primer lugar comprobar la regeneración del cabello en el músculo TA. Si es necesario, volver a aplicar Nair para quitar el pelo como se describe anteriormente, después de anestesiar el ratón con la mezcla de ketamina y xilazina. Mientras que el ratón está bajo anestesia, se coloca el ratón en una posición boca abajo en un pedazo de negro no fluorescente de papel (papel negro Artagain de Strathmore). Para exponer el músculo por completo de asistencia técnica para una mejor imagen, grabamos las patas traseras en el papel. Ponemos el ratón en la cámara de imagen y la posición de la pata trasera a ser reflejado en el centro del campo de visión de la cámara. En primer lugar, cambiar el filtro de emisiones para tomar la tradicional escala de grises imagen fotográfica de la pierna con un tiempo de exposición de 5 segundos. Reajuste la posición del ratón y el enfoque de la cámara si es necesario. Los parámetros de imagen, incluyendo el tiempo de exposición (1.250 ms), altura de la muestra (0.9 cm), etc se mantienen constantes en el proceso experimental. A continuación, cambiar el filtro de emisiones correspondientes a la longitud de onda proteína verde fluorescente. Tomamos la imagen de fluorescencia con un tiempo de exposición de 1.250 ms y un número de intervalos de 1. Después de la filmación, el ratón se retira de la cámara de imágenes a una jaula para esperar la recuperación. Para el análisis, se dibuja una región de interés (ROI) a través de las señales fluorescentes para medir su intensidad en términos de fotones por segundo. También medimos el tamaño del retorno de la inversión en términos de número de píxeles como otro valor de la cuantificación. Los experimentos de imagen se puede repetir cada semana o con mayor frecuencia durante unos meses, si es necesario, para obtener datos longitudinales. Al final de los experimentos, el ratón es la eutanasia y el músculo TA se cosecha para su análisis histológico.