Summary

Сотовый Lineage Анализы и функции генов исследований с использованием Twin-спот MARCM

Published: March 02, 2017
doi:

Summary

Здесь мы приводим протокол для мозаичной техники маркировки, которая позволяет визуализировать нейронов, полученных из общей клетки-предшественника в двух различных цветах. Это облегчает нейронную анализ клонов с возможностью рождения-знакомства отдельных нейронов и изучения функции гена в одних и тех же нейронов разных людей.

Abstract

M osaic в НАЛИЗ с г epressible с ELL м arker (MARCM) является положительным система маркировки мозаики, которая широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований , чтобы изобразить сложные морфологию и манипулировать функции генов в подмножества нейронов в противном случае без опознавательных знаков и невозмущенной организмы. Генетические мозаики, генерируемые в системе MARCM опосредуется через сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами в пределах деления клеток-предшественников, чтобы производить как отмеченные знаком (MARCM клоны) и немаркированные дочерние клетки во время митоза. Расширение метода MARCM, называемый твин-спот MARCM (tsMARCM), этикетки и сдвоенных клеток, полученных от общего предка с двумя разными цветами. Этот метод был разработан для того, чтобы извлекать полезную информацию из обоих Hemi-родословных. Путем всестороннего анализа различных пар tsMARCM клонов, система tsMARCM позволяет высокого разрешения нейронального происхождения MAPPINг выявить точное порядка рождения меченых нейронов, полученных из обычных клеток-предшественников. Кроме того, система tsMARCM также расширяет исследования функции гена, позволяя фенотипический анализ идентичных нейронов различных животных. Здесь мы опишем , как применять систему tsMARCM , чтобы облегчить изучение развития нервной системы у дрозофилы.

Introduction

Мозг, состоящий из огромного количества разнообразных и типов нейронов, жертвует животных со способностью воспринимать, обрабатывать и реагировать на вызовы от внешнего мира. Нейроны взрослого Drosophila центрального мозга получают из ограниченного количества нервных стволовых клеток, называемых нейробласты (NBS), в течение развития 1, 2. Большинство НБС участвующих в нейрогенез головного мозга у дрозофилы проходят асимметричное деление для генерации самообновляющихся NBS и ганглий материнские клетки (GMCS), и GMCs затем пройти через еще один раунд разделения , чтобы произвести две дочерние клетки , которые дифференцируются в нейроны 3 (рис 1А ). Из-за запутанности нейронного морфологии и проблемы, связанные с определением конкретных нейронов, положительно мозаичную технологии маркировки, мозаика анализ с репрессируемый клеток маркером (MARCM), был изобретен для того, чтобы visualizatион одного нейрона или небольшой группы нейронов из популяции окружающих, немеченых нейронов 4.

MARCM использует флиппазы (FLP) / ФЛП целевой системы распознавания (FRT) посредничать сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами внутри клетки – предшественника разделяющая несущего гетерозиготную аллель гена репрессора, экспрессия которого обычно ингибирует экспрессию гена – репортера 4. После того, как митотического деления, рекомбинантные хромосомы разделены на близнецов клетки, таким образом, что одна клетка содержит гомозиготные аллели гена репрессора и другая ячейка не имеет репрессор гена-экспрессию репортера в этой ячейке (и его потомков) больше не является 4 заблокирован. Три клоновых узоры обычно встречаются в MARCM эксперименте, когда ФЛП стохастически индуцируется в NBS или ГМО: одноклеточные и двухкамерные-GMC клоны, которые изображают нейронную морфологию в одноклеточных Resolutioп, и многоклеточные-NB клонов, раскрывающие целые морфологические закономерности нейронов , происходящих от общего NB (рис. 1В) Методика MARCM широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований, в том числе в идентификации нейронов типа для реконструкции мозга по всей проводки сетей, нейронная линия анализа для раскрытия истории развития нейронов, фенотипической характеризации генов функций , участвующих в спецификации клеточных судеб, и нейронный морфогенез и дифференциация изучает 5, 6, 7, 8, 9, 10. Поскольку обычные MARCM только этикетки одну из двух дочерних клеток (и родословных) после индуцированного события митотической рекомбинации, потенциально полезной информации от немаркированной стороны теряется. Это ограничение исключает применение основного МСистема ARCM с высокой разрешающей способностью анализа многих нейронных линий , которые переключают клеточные судьбы в быстром темпе или точности анализа функций генов в одинаковых нейронов различных животных 11, 12.

Twin-спот MARCM (tsMARCM) представляет собой развитую систему , которая маркирует нейроны , полученные от общего предка с двумя различными цветами, что делает возможным восстановление полезной информации с обеих сторон близнецов клеток, таким образом преодолевая ограничения исходной системы MARCM 11 ( Фигура 2А2С). В системе tsMARCM, две РНК – интерференция (RNAi) основе супрессоры расположены в транс-сайтов гомологичных хромосом в клетке – предшественника, и экспрессию этих супрессоров независимо друг от друга ингибируют экспрессию соответствующих репортеров (Фигура 2В). После сайт-специфической рекомбинации митотического опосредованное через систему FLP / FRT, то ТВто RNAi основе супрессоры стали разделены на две односпальные клетки , чтобы разрешить экспрессию различных репортеров (рис 2В). Два клоновых модели, одноклеточные , связанные с одноклеточных клонах и двуклеточной-GMC , связанных с многоклеточным-NB клонов, как правило , рассматривается в эксперименте tsMARCM (рис 2C). Информация, полученная от одной стороны сдвоенных ячеек могут быть использованы в качестве ссылки на другую сторону, что позволяет с высокой разрешающей способностью анализов нейронального происхождения, такие как рождение датирующим меченых нейронов, и фенотипический анализ идентичных нейронов у различных животных для точного расследования нейронной функции гена 11, 12. Здесь мы приводим протокол шаг за шагом , описывающий , как провести эксперимент tsMARCM, который может быть использован в других лабораториях , чтобы расширить свои исследования развития нервной системы (а также развитие других тканей, если это применимо) у дрозофилы.

Protocol

1. Построить tsMARCM готовый Мухи с использованием требуемой трансгенов 11, 13 Сформировать оригинальную версию tsMARCM-готовых мух от трансгенов, которые выполняются отдельными мухами 11 (таблица 1). Проведение стандартных генетически…

Representative Results

Система tsMARCM была использована для облегчения нейронального происхождения анализов и исследований функции генов путем извлечения важной информации о нейронов, происходящих от общих NBS. Система была использована для идентификации большинство (если не все) нейронные ?…

Discussion

Критические шаги в рамках Протокола

Шаги 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, 3.2 и имеют решающее значение для получения хороших результатов tsMARCM. Тканеспецифические драйверы -GAL4 , которые не экспрессируют GAL4 в нервных клеток – предшественников являются предпочтительными для стадий 1.1.1 и 1.2….

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Министерством науки и технологии (MOST 104-2311-B-001-034) и Институт клеточного и Организменные биологии, Академии Синика, Тайвань.

Materials

Carbon dioxide (CO2) Local vendor n.a. Anesthetize flies
CO2 pad Local vendor n.a. Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4 Uniregion Bio-Tech (or other vendors) PBS001 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549 Fix fly brains
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat Jackson ImmunoResearch  005-000-121 Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody Invitrogen MCD0800 Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody Clonetech 632496 Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Invitrogen A11006 Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 Invitrogen A11035 Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent Molecular Probes S36936 Mount fly brains and protect quenching of fluorescence 
PYREX 9 depression glass spot plate Corning 7220-85 Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit World Precision Instruments SYLG184 Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal Sigma-Aldrich 242276-250G Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-30 Dissect and mount fly brains
Micro slide Corning 2948-75×25 Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5 VWR International 48366-205 Mount fly brains
Nail polish Local vendor not available Seal micro cover glass on micro slides
Incubator  Kansin Instruments LTI603 culture flies at 25°C
(or other vendors)
Water bath Kansin Instruments WB212-B2 Induce heat-shock in flies at 37°C
(or other vendors)
Orbital shaker Kansin Instruments OS701 Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope Leica EZ4 Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope Zeiss (or other vendors) LSM 700 (or other models) Image tsMARCM clones
image-processing software 1
(e.g., Zeiss LSM image browser) 
Zeiss not available Project stacks of confocal images
image-processing software 2
(e.g., Image-J) 
not available not available Count cell number of tsMARCM clones

Referências

  1. Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
  2. Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
  3. Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Arias, A. M. . The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
  4. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  5. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  6. Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
  7. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
  8. Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
  9. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genética. 196 (1), 17-29 (2014).
  10. Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
  11. Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
  12. Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Greenspan, R. J. . Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (1997).
  14. Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
  15. Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
  16. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425 (2012).
  19. Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
  20. Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
  21. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  22. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  23. Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).

Play Video

Citar este artigo
Shen, H., Hsu, T., Chung, P., Yu, H. Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM. J. Vis. Exp. (121), e55278, doi:10.3791/55278 (2017).

View Video